葉 雷，陳慶森*，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

乳源酪蛋白糖巨肽對小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

葉 雷，陳慶森*，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

目的：酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）是κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶和胃蛋白酶酶解后形成的含有64個氨基酸的不同種類肽段，具有多種生物學活性和獨特的營養(yǎng)特性，探討CGMP對小鼠外周血 T淋巴細胞亞群的影響。方法：以健康小鼠為實驗動物，利用流式細胞儀分別檢測 長期和短期灌胃不同劑量的CGMP（30、60、120μg/d）后，小鼠外周血 淋巴細胞亞群的變化。結果：乳源CGMP干預后的結果表明，在短期灌胃實驗中，灌胃不同劑量后CD3+淋巴細胞數(shù)比例均顯著降低，12h后恢復灌胃前水平；C D3+CD4+和CD3+CD8+淋巴細胞比例在灌胃30μg和120μg CGMP 4h后均顯著降低，而60μg組則無明顯變化；長期灌胃實驗中，在第2天和第4天，外周血中CD3+淋巴細胞和CD3+CD4+比例與對照組相比顯著升高（P＜0.05）；120μg/d劑量組的小鼠外周血中CD3+CD8+淋巴細胞比例與對照組相比顯著升高（P＜0.05），而30μg/d 劑量組在2、4、6、8d與對照組相比無顯著變化（P＞0.05）；在第2天，30μg/d和120μg/d劑量組外周血中CD3+CD4+/ CD3+CD8+比例與對照組 相比顯著升高（P＜0.05）。結論：乳源CGMP能夠引起正常小鼠的外周血淋巴細胞亞群發(fā)生變化，調節(jié)機體T淋巴細胞亞群的平衡，由此提示CGMP可作為功能性食品對外周血T淋巴細胞亞群的失衡有緩解作用。

酪蛋白糖巨肽；淋巴細胞亞群；CD4+細胞；CD8+細胞；功能性食品

生物活性肽（biological active peptides，BAP）是指能夠調節(jié)生物機體生命活動或具有某些生理活性作用的，一類20種天然氨基酸以不同的組成和排列方式構成的從二肽到復雜的線性、環(huán)形結構的不同多肽的總稱。它們是涉及生物體內多種細胞功 能的生物活性物質，是機體完成分子識別、信號傳導、細胞分化、免疫功能及個體發(fā)育等多種復雜的生理活動必不可少的參與者[1]。牛乳中含有豐富的蛋白質，包括酪蛋白、乳清蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類，其中酪蛋白約占80%，是牛乳蛋白的主體。目前，來源于酪蛋白的生物活性肽主要有：酪啡肽（c asomorphins）、酪激肽（casokinins）、酪新素（casoxins）和來自于κ-酪蛋白的酶解產(chǎn)物酪蛋白糖巨肽（CGMP）等[2]。乳源CGMP是1965年Delfour等[3]發(fā)現(xiàn)κ-酪蛋白的特定位點經(jīng)凝乳酶切斷，生成可溶于三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）的部分多肽產(chǎn)物，因該多肽含有較多的糖鏈，于是被稱為糖巨肽（glycomacropeptide，GMP），而酪蛋白來源的此類肽都統(tǒng)稱為酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）。CGMP是乳清中重要的一種活性多肽，由64個氨基酸殘基組成，含有較多的BCAA（是指亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的總和）序列，而缺少芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。通過對CGMP的結構分析，發(fā)現(xiàn)糖鏈主要有以O-糖苷型結合的2種中性糖鏈和3種酸性糖鏈，90%以上的結合糖鏈都含唾液酸[4]。構效鑒定結果顯示，如果將CGMP中的唾液酸消化掉，則許多生物學活性就會減弱或消失。到目前為止，含有乳源CGMP的功能性食品或添加劑已經(jīng)應用到人們的生活中，日本雪印乳業(yè)株式會社開發(fā)了一種含CGMP乳制品[5]，用來促進人體B淋巴細胞的增殖；近期的研究發(fā)現(xiàn)CGMP可用于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者的保健營養(yǎng)食品，來改善腸內微生態(tài)平衡或調節(jié)免疫功能，從而達到治療效果[6-11]。

大量的研究報道已經(jīng)表明，生物活性肽的免疫調節(jié)作用主要有兩種方式：一種是免疫刺激活性，另一種就是調節(jié)微生態(tài)活性[12-15]。通過體內實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CGMP確實能夠調節(jié)腸道微生態(tài)區(qū)系，促進益生菌的生長，抑制有害菌，使腸道的菌群的數(shù)量和分布更加合理。T淋巴細胞主要包括CD4＋和CD8＋細胞亞群，CD3是成熟T淋巴細胞的標志，CD4＋代表T輔助細胞，是免疫反應的中心細胞，根據(jù)分泌細胞因子的不同，又可以分為Th1、Th2和調節(jié)性T細胞，當激活后，通過分泌不同的細胞因子來調節(jié)機體的細胞免疫和體液免疫；而CD8＋淋巴細胞代表T抑制性細胞和T殺傷性細胞，是免疫反應的效應細胞。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CD4＋和CD8＋細胞在功能上相互協(xié)作，相互制約，維持著正常的動態(tài)平衡，調節(jié)機體正常的免疫功能。一旦這個平衡被打破，就會導致機體的免疫功能紊亂而致病。例如：腹瀉型腸易激綜合癥（D-IBS）就會引起外周血中T淋巴細胞亞群的失衡，CD4+細胞和CD4+/CD8+比值顯著降低，引起免疫調節(jié)異常[16]。

目前，調節(jié)人體免疫功能的食品研發(fā)是食品行業(yè)的熱點之一。人們關注的焦點已經(jīng)轉向營養(yǎng)免疫學領域[17]，特別是營養(yǎng)物質是否既具有營養(yǎng)價值，也具有免疫調節(jié)功能[6,18-19]。事實證明，生物體內和體外研究的作用機理并不相同，在體內由于有各種消化酶和腸道微生物群系的存在，使得CGMP體內免疫作用變得更為復雜，甚至可能得出與體外作用相反的結果。本實驗通過CGMP對外周血淋巴細胞亞群的影響作用，為尋找并力求開發(fā)治療機體免疫功能紊亂方面功能性食品提供科學的理論依據(jù)。綜上所述，尋找并研究一些食源性生物活性物質，對于促進機體內淋巴細胞亞群的平衡，維持機體正常的免疫功能以及新藥的創(chuàng)制具有重要價值[20-22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7周齡昆明雌性小鼠120只，SPF級，平均體質量為（25.53±1.65）g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

乳源CGMP 新西蘭Tatua公司；CD3-FITC、CD4-Percp、CD8α-PE 美國Becton Dickinson公司。

1.2 儀器與設備

FACSCalibur流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；PHS-3B pH計 上海雷磁儀器廠；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；FA2004A電子分析天平 上海精天有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

短期灌胃CGMP的實驗，將24 只昆明小鼠隨機分為3 個劑量組，每組8 只，分別為30 μg組、60 μg組、120 μg組，實驗期間小鼠自由進食和飲水。

連續(xù)灌胃CGMP的實驗，將小鼠隨機分為3 組，每組32 只，分別為0.9%生理鹽水對照組，30 μg/d劑量組和120 μg/d劑量組，期間各組小鼠自由進食和飲水。

1.3.2 樣本采集

短期灌胃CGMP的研究中分別在未灌胃以及灌胃后4、8、12、24 h眼眶取血；連續(xù)灌胃CGMP的研究中分別在灌胃后2、4、6、8 d眼眶取血；將血液放入含有肝素的1 mL離心管內，混勻，4 ℃保存。

1.3.3 三色熒光標記

CD3-FITC、CD4-Percp單抗試劑按1∶9的比例用PBS緩沖液進行稀釋，CD8α-PE稀釋比為1∶4；10×溶血素與蒸餾水按照1∶9的比例進行稀釋。吸取100 μL的抗凝血加入流式管中，分別加入稀釋后的CD3-FITC、CD4-Percp、CD8α-PE單抗各5 μL；另取4 管血樣，按照相同劑量加入同型抗體和單抗組合，作為陰性對照和用于調節(jié)流式細胞儀熒光電壓。渦旋混勻，避光室溫孵育30 min。加入稀釋后的溶血素2 mL，渦旋混勻，避光孵育10 min。1 200 r/min離心5 min，棄上清，用2 mL PBS緩沖液洗滌一次，加入含1%多聚甲醛的PBS溶液0.5 mL混勻，放于4 ℃冰箱中待測。

1.3.4 流式細胞儀分析

淋巴細胞亞群用流式細胞儀進行分析，首先通過調整熒光電壓，使陰性群體位于散點圖的左下角。根據(jù)前向光（forward scatter，F(xiàn)SC）和側向光（side scatter，SSC）圈定淋巴細胞群體。其中CD3＋細胞、CD4＋細胞和CD8+細胞分別用FL1、FL2和FL3通道進行獲取，每管獲取104個細胞。結果用CD3＋細胞、CD3＋CD4＋雙陽性細胞和CD3＋CD8＋雙陽性細胞分別占門內淋巴細胞的百分比表示。利用BD CellQuest Pro數(shù)據(jù)分析軟件對十字門內細胞的比例進行統(tǒng)計。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS16對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和配對t檢驗分析；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01差異極顯著；數(shù)值利用±s表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠外周血T淋巴細胞亞群分群情況的流式細胞術分析

由圖1可知，不同劑量CGMP灌胃后CD3+CD8+雙陽性淋巴細胞亞群和CD3+CD4+雙陽性淋巴細胞亞群均可明顯地分群。

圖1 CGMP對小鼠外周血淋巴細胞亞群影響的流式細胞分析點圖Fig.1 Dot plots representing effects of CGMP on the peripheral blood lymphocytes

2.2 短期灌胃CGMP后外周血T淋巴細胞亞群的變化

2.2.1 短期灌胃不同劑量的CGMP后外周血CD3+淋巴細胞亞群的變化

圖2 不同劑量的CGMP灌胃后外周血CD3+淋巴細胞的變化Fig.2 Effect of different dosages of CGMP on CD3+ cells in peripheral blood after oral administration

由圖2可知，30 μg組在灌胃4 h后，CD3+淋巴細胞數(shù)比例顯著降低（P＜0.01），8 h后降至最低水平，12、24h CD3+淋巴細胞數(shù)比例有所回升但與灌胃前相比差異仍極顯著；60μg組在灌胃4 h后，CD3+淋巴細胞顯著減少（P＜0.05），8、12、24 h與灌胃前相比并無顯著差異；而120 μg/d組在灌胃4、8 h后CD3+淋巴細胞數(shù)量與對照組相比顯著減少（P＜0.01），12 h恢復至灌胃前水平，24 h后與灌胃前相比顯著減少（P＜0.01）。

2.2.2 短期灌胃不同劑量的CGMP后外 周血CD3+CD4+淋巴細胞的變化

圖3 不同劑量的CGMP灌胃后外周血CD3+CD4+淋巴細胞的變化Fig.3 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD4+ cells in peripheral blood after oral administration

由圖3可知，30 μg組在灌胃4 h后CD3＋CD4＋淋巴細胞開始顯著下降，8 h降至最低，12 h后回升至與灌胃前無顯著差異的水平，24 h后又顯著降低（P＜0.01）；60 μg組在灌胃后4、8、12、24 h CD3＋CD4＋淋巴細胞數(shù)量與灌胃前相比均沒有顯著變化；120 μg組在灌胃后4 h，CD3＋CD4＋淋巴細胞顯著降低（P＜0.01），12 h后回升至與灌胃前無顯著差異，24 h后降至最低值。

2.2.3 短期灌胃不同劑量的CGMP后外周血CD3＋CD8＋淋巴細胞的變化

圖4 不同劑量的CGMP灌胃前后24h外周血CD3+CD8+淋巴細胞的變化Fig.4 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD8+ cells in peripheral blood after oral administration

由圖4可知，30 μg組在灌胃4 h后，CD3+CD8+細胞比例顯著降低（P＜0.05），8 h后降至最小值，12 h后回升，與灌胃前水平差異不顯著（P＞0.05）；60 μg組在灌胃前后并無顯著差異（P＞0.05）；120 μg組在灌胃后4h外周血CD3＋CD8＋淋巴細胞數(shù)比例顯著下降（P＜0.01），隨后細胞數(shù)比例維持不變。

2.2.4 短期灌胃不同劑量的CGMP對CD3＋CD4＋/ CD3+CD8+比值的影響

圖5 不同劑量的CGMP灌胃前后24h外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+的變化Fig.5 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD4+ /CD3+CD8+ in peripheral blood after oral administration

由圖5可知，所有劑量組在灌胃后4 h和8 h，與灌胃前相比CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值降低，但并無顯著性差異（P＞0.05），12 h后比值有所升高（P＞0.05），24h后又恢復到灌胃前水平。

2.3 連續(xù)灌胃CGMP后外周血T淋巴細胞亞群的變化

2.3.1 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP后外周血CD3＋淋巴細胞亞群的變化

圖6 不同劑量組的CGMP對小鼠外周血CD3+淋巴細胞的影響Fig.6 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+ lymphocytes in mice

由圖6可知，在灌胃第2天和第6天，120μg/d組小鼠外周血中CD3+淋巴細胞比例與對照組相比顯著升高（P＜0.05）；30μg/d組在連續(xù)灌胃后CD3+淋巴細胞比例均無顯著變化（P＞0.05）。

2.3.2 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP后外周血CD3+CD4+淋巴細胞的變化

由圖7可知，在第2天和第6天，120μg/d組的外周血中CD3+CD4+淋巴細胞比例與對照組相比顯著升高（P＜0.05）；30μg/d組在連續(xù)灌胃階段與對照組相比均無顯著變化（P＞0.05）。

圖7 不同劑量組的CGMP對小鼠外周血CD3+CD4+淋巴細胞的影響Fig.7 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD4+ lymphocytes in mice

2.3.3 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP后外周血CD3+CD8+淋巴細胞的變化

圖8 不同劑量組的CGMP對小鼠外周血CD3+CD8+淋巴細胞的影響Fig.8 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD8+ lymphocytes in mice

由圖8可知，在灌胃第6天，120μg/d組外周血中CD3+CD8+淋巴細胞比例與對照組相比顯著升高（P＜0.05）；而30μg/d組在連續(xù)灌胃階段與對照組相比均無顯著變化（P＞0.05）。

2.3.4 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP對CD3＋CD4＋/CD3＋

CD8＋比值的影響

圖9 不同劑量組的CGMP對小鼠外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的影響Fig.9 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD4+/CD3+CD8+ ratio in mice

由圖9可知，在灌胃第2天，30μg/d組和120μg/d組的小鼠外周血CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值與對照組相比均顯著升高（P＜0.05），隨后兩個劑量組小鼠外周血CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值與對照組相比均無顯著變化（P＞0.05）。

3 討 論

T淋巴細胞在機體細胞免疫和體液免疫中起著極為重要的作用，具有免疫防御、免疫調節(jié)、免疫監(jiān)視等作用。研究資料表明，Th/Tc細胞的平衡在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[17,20]。CD4是T輔助/誘導細胞（Th/Ti）的表面標志，CD4＋T細胞具有輔助T細胞轉變成效應細胞、B細胞轉化成漿細胞以及活化巨噬細胞等功能，起輔助、誘導細胞及體液免疫的作用。CD8＋是T抑制/殺傷細胞（Ts/Tc）的表面標志，CD8＋T細胞具有細胞毒效應，它能抑制T細胞活化、抑制B細胞產(chǎn)生抗體，起抑制細胞及體液免疫的作用。Th細胞是機體免疫應答的中心細胞，CD4＋/CD8＋T（Th/Tc）比例變化反應機體的免疫功能狀況，比例升高表明免疫功能亢進，比例降低表明免疫功能低下。T淋巴細胞亞群之間相互調節(jié)，在正常的生理狀態(tài)，CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋值相對穩(wěn)定，維持機體的正常免疫功能。醫(yī)學上T淋巴細胞亞群的測定是檢測機體細胞免疫功能的重要指標。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)登革熱病毒感染者、冠心病患者、乙肝患者、胃癌患者等的外周血T淋巴細胞亞群都會發(fā)生異常。幾種血液病患者的T淋巴細胞亞群的測定結果表明，原發(fā)性粒細胞減少癥患者的T細胞亞群分布具有明顯的不均一性，主要為CD4＋細胞比例減少，CD8＋細胞比例增多[6]。

本實驗中，當灌胃不同劑 量的CGMP后，通過在一天內不同的時間點來檢測T淋巴細胞亞群的變化趨勢，盡管60μg的劑量不能夠引起CD4＋，CD8＋淋巴細胞的顯著變化，但低、高劑量CGMP4h后都能引起CD4＋、CD8＋淋巴細胞比例的顯著降低，12h后回升至灌胃前水平，與灌胃前相比差異不顯著（P＞0.05）；灌胃后一天內不同階段CD4＋/CD8＋比值有所波動，但是與灌胃前相比，差異不顯著（P＞0.05）；提示若引起CD4＋/CD8＋比例發(fā)生顯著變化，需要進行延長灌胃時間或者增加灌胃劑量，該現(xiàn)象需要進一步的實驗驗證。研究發(fā)現(xiàn)灌胃CGMP 4h就會引起正常小鼠外周血T淋巴細胞亞群顯著減少，因為短期內淋巴細胞增殖很少，可能原因是灌胃CGMP后，作為外來抗原的CGMP，引起腸道黏膜局部免疫，使外周血中的T淋巴細胞向外周免疫器官遷移，即淋巴細胞歸巢（lymphocyte homing），外周血中的T淋巴細胞選擇性的穿越毛細血管后微靜脈（HEV），向外周淋巴器官定向遷移，造成外周血中T淋巴細胞減少。體內的淋巴細胞處于動態(tài)循環(huán)狀態(tài)，由血液進入組織，再從組織進入血液；本實驗室前期的研究結果顯示，CGMP作為抗原通過腸相關淋巴組織和血液循環(huán)進入脾臟從而促進脾臟和PP結以及MLN中CD3＋和CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋細胞的顯著增加[22]，這與本實驗的結果和推斷相一致。因此，CGMP灌胃后，短期內會引起外周血中淋巴細胞數(shù)量的減少；隨后，由于淋巴細胞的再循環(huán)，抗原刺激T淋巴細胞分化、增殖，使得外周血中T淋巴細胞亞群比例回升至正常水平。當連續(xù)灌胃CGMP 2、4、6、8d的結果表明，到第2天，外周血T淋巴細胞亞群顯著升高，CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋的比值增加。這說明CGMP對小鼠T細胞功能具有增強作用，隨著天數(shù)的增加，淋巴細胞亞群的平衡逐漸趨于正常。因此該結果提示，如果連續(xù)給T淋巴細胞亞群失衡的模型小鼠灌胃CGMP，可能會促進外周血中CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋的比值處于正常的水平，但尚需進一步的研究驗證。

4 結 論

本實驗采用口服CGMP干預健康小鼠的方法，流式細胞術分析短期和連續(xù)干預后對外周血T淋巴細胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)乳源CGMP能夠引起正常小鼠的外周血淋巴細胞亞群的變化，根據(jù)CGMP對外周血中T淋巴細胞亞群的影響，可以推斷出CGMP能夠改善免疫功能異常引起的疾病，調節(jié)機體T淋巴細胞亞群的平衡作用。如：腹瀉型腸易激綜合征或炎癥性腸病患者外周血中CD4＋細胞和CD4＋/CD8＋比值顯著降低。因此，CGMP可能對外周血T淋巴細胞亞群的失衡有緩解作用。

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Effect of Milk-De rived Casein-G lycomacropeptide on Peripheral Blo od T Lympho cyte Subsets in Mice

YE Lei, CHEN Qing-sen*, LI Wei, YAN Ya-li, ZHAO Pei, PANG Gua ng-chang, HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Fo od Biotechnology, College of Biotechnology and Food S cience, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: Casein glycomacropeptide (CGMP) is a kind of peptide containing 64 amino acid residues, which has many physiological functions and unique nutritional properties. This study aimed to explore its effects on peripheral blood lymphocyte subsets in mice. Methods: After being by gavage given different doses of CGMP (30, 60, and 120 μg/d), healthy mice were tested for the changes of the peripheral blood lymphocyte by flow cytometry. Results: In the short-term gavage experiment, CGMP resulted in a significant decrease in the proporti on of CD3+, and after 12 h, it recovered to the level before oral administration; CGMP at 30 and 120 μg/d resulted in a significant decrease in the proportions of CD3+CD4+ lymphocytes and CD3+CD8+ lymphocytes in peri pheral blood after 4 h, while CGMP at 60 μg/d resulted in no significant change. In the long-term gavage experiment, CGMP resulted in a significant increase in CD3+ lymphocytes and CD3+CD4+ lymphocytes in peripheral blood at days 2 an d 4 (P ＜ 0.05). Com pared with the control group, CGMP at 120 μg/d resulted in a significant increase in CD3+CD8+ lymphocytes in peripheral blood (P ＜ 0.05), but at 30 μg/d caused no significant increase (P ＞ 0.05). Moreover, at day 2, CGMP at the two dosages resulted in a significant increase in CD3+CD4+/ CD3+CD8+ in peripheral blood (P ＜ 0.05). Conclusion: CGMP can cause peripheral blood lymphocyte subsets to change in mice, and regulate the balance of T lymphocyte subse ts in peripheral blood. Therefore, CGMP can be used as a functional food to relieve the imbalance of T lymphocyte in p eripheral blood.

case in glycomacropeptide (CGMP); lymphocyte subse ts; CD4+ cells; CD8+ cells; func tional food

TS201.4

A

1002-6630（2014）11-0209-06

10.7506/spkx1002-6630-201411042

2014-02-09

國家自然科學基金面上項目（30771524；31071522）

葉雷（1989—），男，碩士研究生，研究方向為生物活性物質與腸道健康。E-mail：yelei20081020@126.com

*通信作者：陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為食源性生物活性物質與腸道健康，蛋白質（酶）資源。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn