超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定茶葉中8 種單、寡糖的含量

王川丕，諸 力，劉 新，張穎彬，周蘇娟

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定茶葉中8 種單、寡糖的含量

王川丕，諸 力，劉 新*，張穎彬，周蘇娟

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

建立同時(shí)定性和定量分析茶葉中鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖8 種單、寡糖的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。樣品經(jīng)超聲波輔助提取，以Waters Acquity BEH Amide色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）分離，以乙腈-水溶液（各含體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水）為流動(dòng)相，電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。結(jié)果表明，8 種單、寡糖的定量檢出限為0.01～0.54 mg/L，線性范圍為1.0～200.0 mg/L；添加水平在10.0 mg/L和100.0 mg/L內(nèi)，回收率為80.2%～103.2%。應(yīng)用該方法分析包含綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶的20 個(gè)樣品，發(fā)現(xiàn)大部分樣品中都能檢測(cè)到葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖，它們的含量分別為0.39～17.64、0.53～22.83、2.07～40.70 g/kg和0.57～14.67 g/kg；但在所有樣品中均未檢測(cè)到鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖。

超高效液相色譜-質(zhì)譜；茶葉；葡萄糖；果糖；蔗糖；棉子糖

糖類(lèi)又稱(chēng)為碳水化合物，是植物光合作用的初級(jí)產(chǎn)物，植物中的絕大多數(shù)成分都是通過(guò)糖類(lèi)合成的，所以糖類(lèi)不僅是植物的貯藏養(yǎng)料和骨架，還是其他有機(jī)物質(zhì)的前體[1]。

糖不僅是茶葉的滋味物質(zhì)[2-3]，給茶湯帶來(lái)甘醇的味道，而且在茶葉的制造過(guò)程中，可發(fā)生焦糖化作用和羰氨反應(yīng)，生成相應(yīng)的醛類(lèi)、吡咯類(lèi)和吡嗪類(lèi)化合物等[4]，對(duì)茶葉的色澤和香氣的形成有重要作用[5-9]；此外研究發(fā)現(xiàn)，單、寡糖具有促進(jìn)人體腸胃蠕動(dòng)，改善腸胃功能，抑制茶湯中兒茶素氧化[10]，增強(qiáng)茶湯抗氧化活性[11]的作用。因此，單、寡 糖是茶葉中重要化學(xué)成分，與茶葉的滋味、湯色和香氣及其生理功能密切相關(guān)，因此建立茶葉中單、寡糖的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)提高茶葉研究水平，控制茶葉產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的作用。

茶葉中的游離單、寡糖因含量少、易轉(zhuǎn)化，至今尚未見(jiàn)有系統(tǒng)的檢測(cè)分析方法的研究報(bào)告，檢測(cè)單、寡糖的方法有離子色譜法[12-13]、氣相色譜法[14]、高效液相色譜法[15-19]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-23]。離子色譜法配合電化學(xué)檢測(cè)器可以分析糖類(lèi)物質(zhì)，但存在色譜峰寬、分離度差、容易產(chǎn)生嚴(yán)重干擾等問(wèn)題。氣相色譜法需要將糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行衍生，以提高目標(biāo)化合物的揮發(fā)性，操作步驟多，過(guò)程比較繁瑣。由于糖類(lèi)物質(zhì)無(wú)紫外吸收，液相方法常采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器或示差檢測(cè)器檢測(cè)，存在方法檢出限低、排除干擾能力差等缺點(diǎn)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、測(cè)定周期短等優(yōu)點(diǎn)[24-25]。

本實(shí)驗(yàn)建立超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS）技術(shù)同時(shí)測(cè)定茶葉中葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖含量的方法，并應(yīng)用該方法對(duì)綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶的20 個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖（純度98%～99%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）、氨水（純度25%、優(yōu)級(jí)純） 德國(guó)默克化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3200型三重四極桿質(zhì)譜 美國(guó)AB公司；Acquity超高效液相色譜 美國(guó)Waters公司；Mill-Q去離子水發(fā)生器 美國(guó)Millipore公司；KQ-5200型超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備

精確稱(chēng)取葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品各1.00 g于100 mL容量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液為溶劑，配制成質(zhì)量濃度10.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

取10.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液添加適量體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度（1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 超聲波輔助提取法制備未加標(biāo)樣品溶液

稱(chēng)取0.30 g樣品（精確至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入25 mL純水，超聲提取15 min，過(guò)濾得到濾液，殘?jiān)?5 mL純水重復(fù)提取1 次，合并2 次提取濾液，加入50 mL乙腈后，用純水定容至100 mL。過(guò)0.22 μm濾膜，UPLC-MS分析。

1.3.2.2 加熱提取法制備未加標(biāo)樣品溶液

稱(chēng)取0.30 g樣品（精確至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入25 mL純水，于100 ℃恒溫水浴中提取15 min，過(guò)濾得到濾液，殘?jiān)?5 mL純水重復(fù)提取1次，合并2 次提取濾液，加入50 mL乙腈后，用純水定容至100 mL。過(guò)0.22 μm濾膜，UPLC-MS分析。

1.3.2.3 加標(biāo)樣品溶液的制備

取10.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液添加適量體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度1.0、10.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用移液器分別吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)液于樣品中，按1.3.2.2節(jié)未加標(biāo)樣品溶液的制備步驟同樣處理。

1.3.3 分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Acquity BEH Amide（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：含體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水溶液（流動(dòng)相A）和含體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水-乙腈溶液（流動(dòng)相B）；流速0.15 mL/min；進(jìn)樣量3.0 μL；柱溫35 ℃；運(yùn)行時(shí)間15 min；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Mobile phase gradient

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

表2 8 種糖的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓Table2 Monitoring ion pairs, collision energy and d e clustering potential of 8 saccharides

電噴霧離子（electron spray ionization，ESI）源；離子源溫度250 ℃；掃描方式：負(fù)離子模式；霧化氣GS1壓力50 psi；霧化氣GS2壓力50 psi；離子噴霧電壓：－500 V；入 口電壓：－8 V；出口電壓：－4 V。各種糖的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)比較超聲輔助提取法[26]和常規(guī)加熱提取法[27]制備綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶樣品提取溶液的效果，如表3所示。由表3可以看出，超聲輔助提取法和加熱提取法相比較，提取效果相近，與文獻(xiàn)報(bào)道[27]一致，考慮到超聲輔助提取法不需要加熱，操作比較方便、提取時(shí)間短、提取效率高、提取液顏色淺，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲輔助提取法制備樣品溶液。

表3 提取方法對(duì)提取的影響（n=3）Table3 Influence of extraction methods (n=3)

2.2 流動(dòng)相流速的選擇

實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[26-27]選擇色譜柱Acquity BEH Amide，流動(dòng)相選擇含體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水溶液（流動(dòng)相A）和含體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水-乙腈溶液。為了解流動(dòng)相流速對(duì)各種單、寡糖的色譜峰強(qiáng)度、半峰寬和分離度的影響，在0.15、0.20、0.3、0.4 mL/min的流速條件下，進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，如圖1～3所示。

圖1 流動(dòng)相流速對(duì)色譜峰強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of flow rate on chromatographic peak intensity

色譜峰強(qiáng)度是目標(biāo)化合物的靈敏度指標(biāo)。如圖1所示，隨著流動(dòng)相流速的降低，各種單、寡糖的色譜峰強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，主要原因是在液相色譜-質(zhì)譜中，尤其是使用ESI源時(shí)，較低的流速減少同時(shí)離子化的化合物數(shù)量，降低待測(cè)成分與基質(zhì)成分在電離過(guò)程中的競(jìng)爭(zhēng)，從而減弱基質(zhì)效應(yīng)。

圖2 流動(dòng)相流速對(duì)色譜半峰寬的影響Fig.2 Effect of flow rate on chromatographic peak half width

半峰寬是色譜峰的峰形指標(biāo)，半峰寬越小，說(shuō)明色譜峰峰寬越窄，提高流動(dòng)相流速有利于減少目標(biāo)化合物在色譜柱上的軸向擴(kuò)散，有利于改善目標(biāo)化合物的峰形。如圖2所示，隨著流動(dòng)相流速的提高，各種糖的色譜峰的半峰寬明顯減小。

圖3 流動(dòng)相流速對(duì)分離度的影響Fig.3 Effect of flow rate on resolution of sugars

分離度（resolution，R）是反映色譜分析方法分離性能的指標(biāo)，為相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。由于峰寬難以準(zhǔn)確測(cè)定，實(shí)驗(yàn)以半峰寬代替峰寬，R越大，表明相鄰兩組份分離越好。一般說(shuō)當(dāng)R＜1時(shí)，兩峰有部分重疊；當(dāng)R=1.0時(shí)，分離度可達(dá)98%；當(dāng)R=1.5時(shí)，R可達(dá)99.7%。通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標(biāo)志。

實(shí)驗(yàn)計(jì)算得各單、寡糖在不同流動(dòng)相流速條件下的色譜峰R，如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨流速提高，除蔗糖和棉子糖外，其他糖分離度都呈下降趨勢(shì)。由于蔗糖和棉子糖的R一直大于1.5，并非分離的難點(diǎn)，且隨流動(dòng)相流速提高，色譜峰強(qiáng)度下降明顯，綜合考慮各種糖的靈敏度、峰形和分離度等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇0.15 mL/min作為實(shí)驗(yàn)流速。

2.3 色譜柱溫度的選擇

色譜柱的分離溫度對(duì)各種單糖的色譜峰強(qiáng)度、半峰寬和峰形有較大的影響，因此，研究不同色譜柱溫度對(duì)各種單、寡糖的分離情況，結(jié)果如圖4、5所示。

圖4 色譜柱溫度對(duì)色譜峰強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of column temperature on chromatographic peak intensity

由圖4可以看出，隨著色譜柱溫度的升高，單糖物質(zhì)色譜峰強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，而棉子糖和蔗糖的色譜峰強(qiáng)度明顯下降，猜測(cè)可能是因?yàn)檫@2 種糖分別為雙糖和三糖，在較高的色譜溫度條件下，容易發(fā)生分解。

圖5 色譜柱溫度對(duì)半峰寬的影響Fig.5 Effect of column temperature on chromatographic peak half width

由圖5 可知，糖類(lèi)為多羥基物質(zhì)，具有較高的黏性，提高色譜柱溫度，有利于減少黏性，改善峰形，色譜柱溫度升高，峰形改善，尤其是對(duì)單糖效果明顯，但考慮到雙糖和三糖在較高的色譜柱溫度條件下，會(huì)產(chǎn)生分解現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)選擇色譜柱溫度35 ℃。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過(guò)針泵進(jìn)樣，在負(fù)離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖等的分子離子。以每種糖的分子離子峰為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對(duì)得到每種糖的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使每種糖的定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大時(shí)為最佳，從而得到每種糖的最佳質(zhì)譜參數(shù)（表1）。

糖為熱敏性物質(zhì)，易在高溫條件下產(chǎn)生各種化學(xué)反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)研究不同離子源溫度條件下，色譜峰強(qiáng)度與離子源溫度的關(guān)系，如圖6所示。

圖6 離子源溫度對(duì)色譜峰強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of source temperature on chromatographic peak intensity

由圖6可知，隨著離子源溫度的上升，各種單糖的色譜峰強(qiáng)度明顯呈下降趨勢(shì)，因此對(duì)于分析糖組分，選擇較低的離子源溫度分析效果較好，由于流動(dòng)相為一定比例的乙腈-水溶液，離子源溫度過(guò)低，會(huì)造成汽化不完全，色譜峰信噪比降低的現(xiàn)象，所以本實(shí)驗(yàn)選擇離子源溫度為250 ℃。

2.5 總離子流圖

實(shí)驗(yàn)采用1.3.3.1節(jié)色譜條件和1.3.3.2節(jié)質(zhì)譜條件，可以較好地分離茶葉中果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖等8 種單、寡糖，總離子流圖如圖7所示。

圖7 8 種糖的MRM色譜圖Fig.7 MRM chromatograms of 8 saccharides

2.6 線性范圍與檢出限

表4 8 種糖的工作曲線回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)、檢出限Table4 Linear equation with correlation coefficients, and limits of detection for 8 saccharides

按1.3.1.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣3 μL，以樣品的色譜峰強(qiáng)度（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，mg/L）進(jìn)行線性回歸，線性范圍為1.0～200.0 mg/L。按3倍RSN計(jì)算定性檢出限，10倍RSN計(jì)算定量檢出限（表4）。

2.7 回收率和精密度

每組準(zhǔn)確稱(chēng)取茶葉樣品3 份，每份0.3 g，共3 組，加入8 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)樣，添加水平分別為10.0 mg/L和100.0 mg/L，按樣品溶液制備方法制備后進(jìn)行測(cè)定。其回收率和精密度見(jiàn)表5，加標(biāo)回收率為80.2%～103.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～9.2%（n=3）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方法基質(zhì)效應(yīng)較小，可能是因?yàn)闃悠诽崛囟鹊汀悠啡芤褐刑岢鑫镔|(zhì)較少所致。

表5 茶樣品中8 種糖的加標(biāo)回收率（n=3）Table5 Recoveries and precisions for 8 saccharides in tea sample (n=3)

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)浙江杭州茶葉市場(chǎng)銷(xiāo)售的綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶4大茶類(lèi)2 個(gè)茶樣品進(jìn)行了分析測(cè)定（表6）。

表6 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果（n=3）Table6 Analytical results of real samples (n=3)

結(jié)果表明，在所有茶葉樣品中均未檢測(cè)到鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖，在所有茶類(lèi)中均檢測(cè)到葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖，葡萄糖含量為0.39～17.64 g/kg、果糖含量為0.53～22.83 g/kg、蔗糖含量為2.07～40.70 g/kg，棉子糖含量為0.57～14.67 g/kg。同類(lèi)型不同茶葉樣品中糖含量的差異懸殊，可能是收集的茶葉樣品的品種不同、制作原料的老嫩度不同和加工工藝多樣化所致。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)表明，本法樣品操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，明顯提高了檢測(cè)效率，適用于快速測(cè)定茶葉樣品中 鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖的含量。

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Determination of Eight Saccharides in Teas by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Chuan-pi, ZHU Li, LIU Xin*, ZHANG Ying-bin, ZHOU Su-juan
(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China)

An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was develope d for the qualitative and quantitative determination of eight saccharides including rhamnose, xylose, arabinose, fructose, mannose, glucose, sucrose, and raffi nose in teas. Samples were extracted with the assistance of ultrasound. The extract was separated on a Waters Acquity BEH Aminde HPLC column (2.1 mm × 150 mm, 1.7 μm) using acetonitrile-water mixture (each containing 0.1% ammonia) as the mobile phase. The electrospray ionization tandem quadrupole mass spect rometric analysis was carried out in the negative ion mode using multiple reaction monitoring (MRM). The limits of detection were 0.01-0.54 mg/L and the linear ranges were 1.0-200.0 mg/L. The average recoveries were 80.2%-103.2% at spiked levels of 10.0 and 100.0 mg/L. The method was applied to analyze 20 tea samples including green tea, oolong tea, Pu’er tea and black tea. Glucose, fructose, sucrose and raffi nose were detected in most of the samples, and their contents were in the ranges of 0.39-17.64, 0.53-22.83, 2.07-40.70, and 0.57-14.67 g/kg, respectively. However, rhamnose, xylose, arabinose and mannose were not detected in all the samples.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; tea; glucose; fructose; sucrose; raffi nose

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0164-06

10.7506/spkx1002-6630-201420033

2014-01-08

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（nycytx-26）

王川丕（1977—），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)椴枞~質(zhì)量與安全。E-mail：wangchuanpi@tricaas.com

*通信作者：劉新（1961—），男，研究員，學(xué)士，研究方向?yàn)椴枞~加工與品質(zhì)檢驗(yàn)。E-mail：liuxin@tricaas.com