■劉旭輝 楊亞晉 蔡 軍 商婷婷 張日俊

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193；2.西南農(nóng)林大學生命科學學院，云南昆明650224）

豆粕作為畜禽最重要的植物性蛋白源被廣泛地 運用到飼料中。但由于豆粕中存在大豆球蛋白、β-大豆伴球蛋白和胰蛋白抑制因子等多種抗營養(yǎng)因子，其應(yīng)用受到很大的限制[1-3]。豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵，抗營養(yǎng)因子被降解至相當?shù)偷臐舛?，甚至被完全消除。大分子蛋白含量降低，水溶性蛋白、小肽和小分子蛋白含量得以提高，脲酶活性降低[4]，磷的有效含量提高[5-6]。同時，因生成了大量的益生菌、乳酸和未知生長因子等物質(zhì)[7]，使其成為了一種優(yōu)質(zhì)的功能性蛋白原料[8]。

微生物發(fā)酵已成為一種消除豆粕中抗營養(yǎng)因子，提高豆粕營養(yǎng)價值的常用方法。但因為所采用豆粕原料品質(zhì)的差異，發(fā)酵用菌種和發(fā)酵策略的不同，所得到的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。行業(yè)中沒有通行的標準加以規(guī)范，缺少評價體系[3]。又因為技術(shù)不成熟，發(fā)酵成本相對較高，使得應(yīng)用最為廣泛的還是豆粕，而不是更為優(yōu)良的發(fā)酵豆粕。發(fā)酵豆粕要被大家廣泛地接受，其重點、突破點便是尋找更加優(yōu)秀的菌種，更加高效地去除抗營養(yǎng)因子，更加高效地提高肽含量。本研究從提高肽含量這點出發(fā)，旨在通過自主設(shè)計的ND雙層平板，結(jié)合豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基，從生境中篩選適用于豆粕發(fā)酵的高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

豆豉和豆腐乳（購自超市）、健康豬禽腸道內(nèi)容物、土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂：蛋白胨1%、NaCl 0.5%、牛肉浸膏0.3%、瓊脂2%，pH值7.2，121℃滅菌20 min。

脫脂牛奶瓊脂：脫脂奶粉5%、瓊脂1%，115℃滅菌20 min。

芽孢種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.02%、CaCl20.02%，pH值7.0，121℃滅菌20 min，下文中省略為“種子”。

ND雙層平板：上層為營養(yǎng)瓊脂，下層為脫脂牛奶。分別配制100 ml的營養(yǎng)瓊脂和100 ml的脫脂牛奶瓊脂，滅菌后，室溫冷卻至60℃左右時倒板。先倒脫脂牛奶10 ml于平板中，待冷卻凝固后再倒入營養(yǎng)瓊脂10 ml。

豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕（過60目）2%、葡萄糖1%、Na2HPO4·12H2O 0.4%、KH2PO40.03%、CaCl20.1%，pH值自然，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 初篩

樣品于8.5%無菌生理鹽水中均質(zhì)后，80℃水浴10 min。10倍梯度稀釋至一定倍數(shù)，取后三個梯度各100 μl，涂布于ND雙層平板。平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑選周圍有明顯透明水解圈的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。對初步選定的菌株劃線純化，并保種備用。

1.2.2 復(fù)篩

初篩得到的菌株接種于芽孢種子培養(yǎng)基，180 r/min、37℃培養(yǎng)18 h?；罨蟮木N按2%接種量接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min、37℃培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液，4℃、10 000 r/min離心10 min。用Folin-酚法測定上清液蛋白酶活性，參照《GB/T 23527—2009蛋白酶制劑》附錄B酶活力測定方法的福林法進行。

1.2.3 生長曲線

根據(jù)裝液量（50 ml/250 ml、30 ml/100 ml）、培養(yǎng)基（豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基、芽孢種子培養(yǎng)基）、接種菌齡（12、24 h）及保存方式（現(xiàn)培養(yǎng)、4℃保存）的不同，繪制生長曲線。試驗分組及處理見表1，每隔2 h取樣，適度稀釋后用紫外分光光度計測定OD600nm。

表1 試驗分組及處理

1.2.4 產(chǎn)酶曲線

按2%接種量將目標菌株接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h取樣，4℃、10 000 r/min離心，上清經(jīng)緩沖液適度稀釋后，測定蛋白酶活性。由此繪制得產(chǎn)酶曲線，以確定菌株的最高產(chǎn)酶量、最高產(chǎn)酶時間及產(chǎn)酶隨時間的變化關(guān)系。

1.2.5 菌種鑒定

1.2.5.1 16S rDNA測序

提取目標菌株基因組作為模版，利用通用引物進行PCR擴增后測序。引物序列：上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下 游 引 物 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'；反應(yīng)體系 50 μl：DNA模板1 μl，2×Taq PCR Mix 25 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，ddH2O 20 μl；擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。細菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化有限公司，引物合成及PCR產(chǎn)物測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。測序結(jié)果經(jīng)Blast在線比對后，運用ClustalX 2和MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5.2 GyrA測序

提取目標菌株基因組作為模版，以GyrA特異性引物進行PCR擴增后測序。引物序列：上游引物5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'，下游引物 5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3'；反應(yīng)體系：50 μl：DNA模板1 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl，ddH2O 20 μl；擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸75 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。結(jié)果分析同16S rDNA測序。

1.3 統(tǒng)計分析

運用Excel對數(shù)據(jù)初步整理后采用SAS 9.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。作圖由Graphpad Prism 5完成。

2 試驗結(jié)果

2.1 初篩結(jié)果

通過觀察菌株生長在上層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面的菌落形態(tài)、菌落周圍的水解透明圈情況、革蘭氏染色及鏡檢情況，初步確定7株產(chǎn)蛋白酶比較豐富的G+芽孢桿菌進入復(fù)篩。菌落在培養(yǎng)基上的生長及水解透明圈情況見圖1。

圖1 初篩結(jié)果，左圖為背面拍攝的一塊平板，右圖為正面拍攝的一個菌落

2.2 復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的7株菌接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基，按1.2.2設(shè)計進行復(fù)篩。各菌株在豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵上清液中蛋白酶活性，測定結(jié)果見表2。從中篩選得到T1，它來自豆豉樣品。

表2 復(fù)篩結(jié)果

2.3 T1的生長曲線

根據(jù)1.2.3設(shè)計，繪制T1在0～24 h時間段的生長曲線，見圖2。從A、B、C、D曲線圖形基本一致可以看出，不同的接種菌齡、裝液量和本試驗用到的兩種不同的培養(yǎng)基對T1的生長沒有明顯的影響。生長曲線的前段存在明顯差異的E組因接種的是4℃保存斜面培養(yǎng)基上的菌落，它需要更多的時間才進入對數(shù)生長期。

圖2 T1的生長曲線

2.4 T1產(chǎn)蛋白酶的時間曲線

圖3為接種T1產(chǎn)蛋白酶曲線，從中可以看出0～42 h上清液中蛋白酶活性逐漸升高，在42 h時達最高值，為1 683.99 U，而后趨于平緩甚至降低。

圖3 T1產(chǎn)蛋白酶活曲線

2.5 菌種鑒定結(jié)果

16S rDNA鑒定結(jié)果：以T1的基因組為模版PCR擴增得到1 465 bp的特異性產(chǎn)物。經(jīng)NCBI Blast比對，T1與Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum strain M20J和Bacillus subtilis strain CICC10265的同源性最高，相似度都達99%，從而鑒定T1為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌。由Clustal X2和MEGA 5.1構(gòu)建的進化樹見圖4，樹枝上的數(shù)字表示Bootstrap驗證中該樹枝可信度的百分比。

圖4 T1 16S rDNA鑒定結(jié)果

Gyrase A鑒定結(jié)果：以 T1的基因組為模版，通過Gyrase A部分序列擴增得到937 bp的PCR產(chǎn)物。經(jīng)NCBI Blast比對，T1與Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum YAU B9601-Y2和Bacillus amyloliquefaciens Y2同源性最高，這兩株菌都屬于解淀粉芽孢桿菌，由此鑒定得T1為解淀粉芽孢桿菌，結(jié)果見圖5。

圖5 T1 GyrA鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的篩選

篩選產(chǎn)蛋白酶的微生物，大家普遍采用酪素平板[9-11]或脫脂牛奶平板[12]。試驗中發(fā)現(xiàn)酪素平板上面的蛋白水解透明圈不明顯，存放幾天后甚至消失。脫脂牛奶平板營養(yǎng)不豐富，某些不能利用乳糖的細菌在其上幾乎不生長；同時由于培養(yǎng)基表面過于濕潤光滑，某些能利用乳糖作為碳源的細菌在上面生長時菌落擴散十分厲害，不利于觀察。并且，以上兩種培養(yǎng)基都不能夠在篩菌的同時從菌落形態(tài)上對生長的菌株進行初步的判斷。

熊濤等[13]在篩菌時用到雙層平板，其下層為瓊脂水，上層為一般性培養(yǎng)基，目的是要在平板內(nèi)創(chuàng)造更加適合厭氧菌生長的厭氧環(huán)境。本試驗從篩選產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌這一目的出發(fā)，創(chuàng)新采用ND雙層板。菌落在上層營養(yǎng)瓊脂表面正常生長，生長過程中產(chǎn)生的蛋白酶擴散至下層，水解下層的脫脂牛奶，形成透明圈。本方法在檢查蛋白酶活性的同時可以對菌株形態(tài)學進行觀察，對菌株種類做出初步的判定。同時還克服了脫脂牛奶平板對于細菌生長營養(yǎng)不全和酪素平板透明圈不明顯的缺點。

3.2 T1產(chǎn)蛋白酶及生長情況

孫妍等[10]從納豆中篩選得到一株納豆芽孢桿菌NB1，發(fā)酵液中蛋白酶活性為19.41 U/ml。馬桂珍等[12]從土壤中篩選得到一株地衣芽孢桿菌GD-2-2，酶活力為447.6 U/ml。王振華[11]從其實驗室保存菌株中篩選出一株枯草芽孢桿菌，蛋白酶活為446.889 U。熊濤等[13]從豆制品中篩選得到一株枯草芽孢桿菌NCU646，厭氧條件下在豆粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h后蛋白酶活達9 600 U/g。本試驗篩選得到的解淀粉芽孢桿菌T1在豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)42 h，上清液蛋白酶活性可達1 683.99 U。從生長曲線還能看出T1生長迅速，8～9 h便能達到穩(wěn)定期，16 h后芽孢迅速增多，體現(xiàn)在曲線后段的再一次攀升。

3.3 T1的鑒定

枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌同屬于枯草芽孢桿菌組的菌種，由于親緣關(guān)系很近，序列間相似度很高，不能通過16S rDNA將他們有效地分開。有研究者發(fā)現(xiàn)，以編碼蛋白的基因作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定標記可以彌補這一缺陷，如DNA促旋酶A亞基編碼基因GyrA[14]。本試驗先通過16S rDNA測序，確定T1為枯草芽孢桿菌屬，但不能區(qū)分開T1是枯草芽孢桿菌還是解淀粉芽孢桿菌。在此情況下，克隆了部分GyrA基因用于測序，并最終鑒定T1為解淀粉芽孢桿菌。

4 結(jié)論

①運用ND雙層平板和豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基從豆豉中篩選得到一株高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌T1。它在豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)42 h，上清液蛋白酶活性可達1 683.99 U。

②通過16S rDNA和GyrA部分序列擴增測序，鑒定T1為解淀粉芽孢桿菌。