趙曉蕾 蔡 林 鄧洲銘

microRNA 與骨肉瘤的研究進展

趙曉蕾 蔡 林 鄧洲銘

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的骨惡性腫瘤，它的第二個好發(fā)高峰是在 70～80 歲的老年人[1]。在美國，每年新發(fā)的骨肉瘤患者約為 900 例[2]。美國癌癥中心的數據顯示，骨肉瘤患者的 5 年生存率約為 53.9%[3]。新輔助化療的應用使得骨肉瘤的 5 年生存率有了明顯提高，但是仍有一部分患者對化療不敏感，同時腫瘤的復發(fā)和轉移一直是治療的難題。雖然骨肉瘤相對于其它腫瘤而言較為少見，但是由于它的高致死率和致殘率，有關骨肉瘤的基礎研究和臨床治療策略一直是醫(yī)學界的研究熱點。之前的研究已經發(fā)現骨肉瘤細胞中存在多種遺傳學改變，包括染色體結構的異常、缺失等以及腫瘤抑制基因的突變。DNA 的甲基化等表觀遺傳學的改變也會導致骨肉瘤的發(fā)生。盡管有關骨肉瘤的基礎研究層出不窮，但是有關 microRNAs ( miRNAs ) 在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中所起的作用仍不是十分明確[4]。

miRNAs 是一類長約 22 核苷酸的非編碼的單鏈 RNA分子，它們廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細胞中[5]。1993 年，科學家們首次在線蟲中發(fā)現了 miRNA[6-7]，目前在哺乳動物中確認的 miRNA 數目已經成千上萬個[8]。以往的研究認為 miRNA 通過與靶 mRNA 形成不完成互補雙鏈來阻遏翻譯，但 2006 年 Wu 等[9]的研究發(fā)現 miRNA 與靶蛋白不完全互補后，除了阻遏翻譯外還可以引起 mRNA快速脫腺苷酸化而被降解以抑制基因的表達。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現 miRNA 在許多生物學過程中都發(fā)揮著重要作用，包括細胞周期的調控、細胞的生長與分化、凋亡以及胚胎發(fā)育等等[8]。miRNA 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系也是生命科學研究的熱點，研究者發(fā)現 miRNA 在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[10]。本研究將近年來miRNA 與骨肉瘤的研究進展綜述如下。

骨肉瘤中差異性表達的 miRNA

以往認為骨肉瘤主要來源于分化異常的成骨細胞，但是最近的研究認為骨肉瘤可能起源于多能干細胞 ( 間質干細胞 )。間質干細胞在向成骨細胞分化的過程中發(fā)生遺傳學的改變，從而分化為異常的骨肉瘤細胞[11]。目前在其它腫瘤中，已有研究提示 miRNA 可能通過參與調節(jié)腫瘤干細胞的分化過程從而導致腫瘤的發(fā)生，但是這一機制在骨肉瘤發(fā)生中的作用尚不清楚[12]。miRNA 的異常表達在腫瘤的發(fā)生中起著重要作用，更重要的是腫瘤的 miRNA 表達譜具有高度特異性，相對于 mRNA 表達譜確定腫瘤的分類更具有意義，可以作為診斷腫瘤的新技術手段[13]。Sarver 等[14]對代表 22 個不同病理類型的肉瘤的 300 個標本 ( 包括 15 個骨肉瘤標本 ) 的 miRNA 表達譜進行了聚類分析，發(fā)現與其它肉瘤 ( 如滑膜肉瘤、纖維肉瘤、胃腸道間質瘤、惡性纖維組織細胞瘤 ) 相比，骨肉瘤的 miRNA 表達譜具有明顯的特異性[14]。研究發(fā)現 miRNA 通過直接或者間接地與靶蛋白結合從而發(fā)揮癌基因或者抑癌基因的作用。例如，miR-373 能夠通過抑制 p53 通路的信號傳導，從而促進腫瘤的發(fā)生，而 let-7 和 miR-98 可以通過下調Ras 和 Myc 癌基因的表達從而抑制腫瘤的發(fā)生[15]。多項研究采用 miRNA 表達譜技術對 miRNA 的在骨肉瘤中的差異性表達進行了分析[4,10,16-18]。

Jones 等[10]使用 miRNA 芯片檢測 18 例骨肉瘤標本與正常骨組織中 miRNA 的表達譜，結果發(fā)現有 34 個 miRNA表達差異有統(tǒng)計學意義，其中 11 個高表達，23 個低表達。作者同時對傳統(tǒng)中央型骨肉瘤、毛細血管擴張型骨肉瘤、軟骨母細胞型骨肉瘤以及軟組織肉瘤的 miRNA 表達譜進行了比較，發(fā)現這些骨肉瘤的 miRNA 表達譜差異較小，提示 miRNA 可能代表一種共有的致瘤程序而與細胞分化狀態(tài)無關[10]。Thayanithy 等[18]對代表 22 種類型肉瘤的 300 多例標本進行了分析，結果發(fā)現與其它肉瘤相比，骨肉瘤中位于基因族位點 14q32 的 miRNA 明顯低表達，而 miR-17-92 族則明顯高表達。作者進一步對骨肉瘤與正常骨組織的 miRNA 表達譜進行了分析，調整倍數超過2 的 miRNA 共有 36 個，基因族位點 14q32 的 miRNA 在骨肉瘤中均下調 5～6 倍，而 miR-17-92 族均明顯上調。骨肉瘤細胞系與成骨細胞系的 miRNA 表達譜分析結果與上述內容基本一致。魏任雄等[16]提取 7 例骨肉瘤組織和正常骨組織的 miRNA，用 miRNA 芯片進行分析，結果發(fā)現骨肉瘤中上調的 miRNA 有 28 個，下調的有 26 個。Maire 等[17]對 7 個骨肉瘤標本與正常成骨細胞的 miRNA表達譜進行了研究，發(fā)現有 38 個 miRNA 的表達存在明顯差異性，高表達的 miRNA 有 10 個，低表達的有 28 個。其中上調倍數最高的 miR-451 和 miR-497，下調倍數最高的為 miR-100 和 miR-154。作者認為這些表達失調的miRNA 主要通過轉錄后調控與骨肉瘤發(fā)生相關的細胞通路和基因[17]。Novello 等[19]對骨肉瘤標本和正常組織的表達譜對比發(fā)現，40 個 miRNA 的表達存在差異，其中 80%的 miRNA 在骨肉瘤標本中表達下降，其中下調程度最大的分別為 miR206，miR-1，miR-133a 以及 miR-133b。Duan 等[20]發(fā)現，與正常成骨細胞相比，骨肉瘤中存在差異性表達的 miRNA 共有 5 個，其中高表達的為 miR-151-3p 和 miR-191，低表達的為 miR-199a-3p，miR-127-3p 以及 miR-376c。Hu 等[21]對骨肉瘤細胞和成骨細胞系的 miRNA 表達譜進行了比較，發(fā)現了 268 個 miRNA在兩者之間的表達存在差異，其中表達上調的有 miR-9，miR-99，miR-195，miR-148a 和 miR181a，表達下調的有miR-143，miR-145，miR-335 和 miR-539。Lulla 等[4]對骨肉瘤標本、骨肉瘤細胞系以及正常成骨細胞的 miRNA表達譜進行了比較，發(fā)現了 22 個表達差異性的 miRNA，而骨肉瘤標本、骨肉瘤細胞系、成骨細胞之間的兩兩比較，骨肉瘤 ( 骨肉瘤標本與骨肉瘤細胞系 ) 中均高表達的共 4 個 miRNA ( miR-135b、miR-150、miR-542-5p 以及 miR-652 )。這其中低表達的 miR-135b 已經被證實在成骨細胞的正常發(fā)育和礦化過程中起著重要的作用，高表達 miR-135b 會導致不正常的礦化以及成體干細胞異常分化[22]。這一結果也許可以解釋 miRNA-135b 在骨肉瘤中高表達的原因。

骨肉瘤中起著癌基因作用的 miRNA

miRNA 主要通過抑制它的靶基因來起調控作用，至今尚未發(fā)現具有上調靶基因能力的 miRNA。如果 miRNA的靶基因是抑癌基因，那么這些 miRNA 可以促進腫瘤的發(fā)生，因此可以將它們視為癌基因。miR-21 在多種腫瘤中被證實為致癌基因。通過對 8 組骨肉瘤以及正常組織、MG-63 細胞的對比，Ziyan 等[23]發(fā)現 miR-21 在骨肉瘤組織中明顯過表達，進一步研究發(fā)現 miR-21 能夠通過降低RECK 基因 ( 一種腫瘤抑制基因 ) 的表達，而 RECK 基因能夠抑制基質金屬蛋白酶的活性，從而促進骨肉瘤細胞的細胞侵襲和遷移能力，有研究證實 RECK 基因與骨肉瘤的 5 年生存率、復發(fā)以及轉移密切相關[24-25]。Montanini等[26]的研究發(fā)現，miR-93 在 MG-63 ( p53-/-) 和 Saos-2 ( p53-/-) 細胞系中表達與成骨細胞系無明顯差異，而在143B 細胞系 ( p53+/+) 中則明顯高表達。上調 miR-93 的表達后，143B 細胞系的增殖能力增加，而 MG-63 細胞系則無明顯變化。作者推測在 p53 陽性表達的細胞中，miR-93可能通過調節(jié) E2F1，從而抑制 p21 轉錄后表達，促進腫瘤的發(fā)生和轉移[26]。

骨肉瘤中起著抑癌基因作用的 miRNA

Jones 等[10]通過實驗證明了 miR-16a 在骨肉瘤的發(fā)生中起著抑癌基因的作用，骨肉瘤細胞系與正常成骨細胞系相比，miR-16a 的表達明顯下降。裸鼠成瘤實驗證實過表達 miR-16a 的骨肉瘤細胞所形成的腫瘤體積和重量都要明顯小于對照組，同時 caspase-3 的活性要高于對照組。He 等[27]的研究發(fā)現 miR-34 在骨肉瘤中表達明顯降低，miR-34 作為 p53 的下游分子，能夠上調 CDK6、E2F3、CyclinE2 以及 Bcl-2 的表達，從而促進腫瘤細胞的凋亡。Wu 等[28]的研究證實 miR-34a 能夠通過下調 Eag1蛋白從而抑制骨肉瘤的增殖。Yan 等[29]通過體內外實驗證實，過表達 miR-34a 能夠抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移能力，同樣也能抑制小鼠模型中骨肉瘤的生長和肺部轉移的發(fā)生率。作者發(fā)現 c-Met 是 miR-34a 的靶基因之一，miR-34a 可能還通過其它的途徑參與調節(jié)骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展過程。Zhang 等[30]的研究發(fā)現 miR-143 在骨肉瘤組織和細胞系中低表達，Bcl-2 為 miR-143 的靶基因之一。提高 miR-143 的表達能夠降低腫瘤細胞活性，促進細胞凋亡。Braun 等[31]發(fā)現在表達野生型 p53 的骨肉瘤細胞U2OS 中，p53 能夠誘導 miR-192、miR-194 以及 miR-215的表達，同時 miR-192 以及 miR-215 能夠誘導 p21 蛋白( p53 基因的產物 ) 的表達，轉染 miR-192 后能使 U2OS 細胞的增殖潛能下降。miR-31 也與 p53 通路密切相關，過表達 miR-31 能夠明顯抑制 U2OS 的增殖[32]。有研究發(fā)現miR-125b 能夠下調 STAT3，而與 miR-199a-3p 能夠下調mTOR 和 STAT3 的表達，從而抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移能力[20,33]。Jin 等[34]的研究證實 miR-376c 能夠下調TGFA 蛋白的表達從而抑制骨肉瘤的增殖和侵襲能力。

與骨肉瘤轉移相關的 miRNA

肺部是骨肉瘤轉移最常見器官，肺部轉移也是骨肉瘤患者的主要死因。約 80% 的骨肉瘤患者，在診斷為骨肉瘤時已經發(fā)生了無癥狀的肺部的微小轉移灶[35]。骨肉瘤一旦發(fā)生肺部轉移，意味著患者的預后不良，即使采取多種治療手段，其 5 年生存率大約在 25%～30%[36-38]。骨肉瘤肺外轉移也是治療的難題之一[35]。

Jones 等[10]對發(fā)生轉移的骨肉瘤和未轉移的骨肉瘤標本的 miRNA 譜進行了比較，發(fā)現有轉移的骨肉瘤標本中，miR-181c 和 miR-27a 的表達明顯增加，上調倍數分別為 1.75 和 4.53。作者同時通過骨肉瘤細胞系和動物實驗驗證了 mir-27a 能夠明顯增加骨肉瘤的轉移能力。Osaki等[39]使用小鼠肺轉移模型中，比較了 HOS 以及 143B 骨肉瘤細胞的 miRNA 表達譜 ( 143B 是 HOS 的亞克隆，具有高轉移能力 )。結果發(fā)現 143B 中的 miR-143 的表達明顯降低，轉染 miR-143 的 143B 細胞的侵襲性明顯下降，但是增殖能力無明顯變化。同時靜脈注射 miR-143 后，能夠明顯抑制 143B 細胞在小鼠中肺轉移的發(fā)生率。免疫沉淀反應發(fā)現 MMP-13 是 miR-143 的靶蛋白，作者認為miR-143 的低表達導致 MMP-13 的上調，從而促進骨肉瘤的轉移能力[39]。Huang 等[40]的研究發(fā)現，過表達 miR-20a會降低骨肉瘤細胞系 SAOS-2 細胞系中 Fas 蛋白的表達，從而增加骨肉瘤細胞的轉移能力。Yan 等[29]發(fā)現 miR-34a能夠下調 c-Met ( 與腫瘤轉移密切相關的蛋白 ) 的表達。動物實驗發(fā)現，表達 miR-34a 的小鼠骨肉瘤肺部轉移的瘤灶的數目、體積都要明顯低于對照組，提示 miR-34a能夠抑制骨肉瘤的轉移[29]。Mao 等[41]發(fā)現 miR-195 能夠通過作用于靶基因 FASN 從而抑制骨肉瘤的遷移和侵襲能力。

與骨肉瘤化療敏感性相關的 miRNA

目前手術切除是骨肉瘤患者主要的治療手段，但是輔助化療以及新輔助化療能夠明顯改善骨肉瘤患者的預后。術前新輔助化療使得骨肉瘤患者的無病生存率由原來的＜20% 提高到 55%～75%，同時使得 80% 的骨肉瘤患者可以避免截肢手術[35]。多中心的隨機對照試驗證實，使用輔助化療的骨肉瘤患者與不接受化療的對照組相比，6 年的無病生存率明顯高于對照組 ( 61% 比 11%，P＜0.001 )[42]?；熋舾行耘c骨肉瘤患者的預后密切相關，但是目前 40% 的骨肉瘤患者仍然對化療不敏感[43]。研究者通過改良輔助化療藥物等方式來提高化療敏感性，但是效果并不理想。目前仍沒有發(fā)現與骨肉瘤化療敏感性確切相關的標記物。多項研究對 miRNA 與化療敏感性之間的關系進行了報道[44-45]。

Jones 等[10]將對化療敏感與不敏感的骨肉瘤的 miRNA表達譜進行了研究，同時通過 RT-PCT 驗證發(fā)現 miR-451與 miR-15b 是在化療不敏感的骨肉瘤中表達倍數明顯下調，下調倍數為分別 5.26 和 2.38。Song 等[44]通過體外實驗證實 miR-215 能夠通過作用于細胞周期調控相關的核蛋白，使骨肉瘤細胞停滯于 G2 期，從而導致骨肉瘤對甲氨蝶呤和雷替曲塞產生化療抵抗。Song 等[45]的研究發(fā)現 miR-140 能夠通過抑制組蛋白去乙酰酶 4 ( HDAC4 ) 的表達，從而導致骨肉瘤細胞對甲氨蝶呤和 5-氟尿嘧啶的不敏感性。該研究還發(fā)現過表達 miR-140 能夠誘導 U2OS和 MG-63 細胞發(fā)生 G1 及 G2 期阻滯，抑制骨肉瘤細胞增殖。Gougelet 等[46]為了研究與骨肉瘤化療敏感性相關的miRNA，使用異環(huán)磷酰胺對骨肉瘤標本、骨肉瘤細胞系以及骨肉瘤模型小鼠的樣本進行化療，檢測其 miRNA 表達譜。作者采用監(jiān)督層次聚類算法對結果進行分析后發(fā)現，共有 5 個 miRNA 與骨肉瘤的化療敏感性密切相關，化療敏感性好的骨肉瘤中 miR-92a、miR-99b、miR-193a-5p、miR-422a 過表達，而 miR-132 低表達。作者進一步通過生物信息學發(fā)現，這 5 個 miRNA 通常都通過 MAP 激酶、TGFβ 以及 Wnt 通路參與細胞周期調控、細胞侵襲以及骨吸收等過程。Wang 等[47]發(fā)現，過表達 miR-138 能夠下調磷酸化的組蛋白 ( γH2AX ) 的表達，導致細胞在 DNA 損傷以后產生染色體不穩(wěn)定，從而提高骨肉瘤細胞對化療的敏感性。

目前為止，尚不清楚哪一種異常機制是骨肉瘤發(fā)病的主要原因。骨肉瘤的發(fā)病機理非常復雜，與多種基因和細胞遺傳學的異常有關，包括癌基因和抑癌基因的突變，染色體增加、缺失、異位等，主要信號轉導通路的失調，端粒酶的活性異常等等，主要與染色體 1、9、10、13、17，以及 p53 和 Rb 基因的異常有關[48]。大多數學者認為骨肉瘤是由于間質干細胞在向成骨分化過程中受阻所致[48-50]。miRNA 參與多種重要生命過程中的調控，同時也證實在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[5,15]。有關骨肉瘤中差異性表達的 miRNA 的研究發(fā)現，骨肉瘤中存在特異性表達的 miRNA 譜，這一特點可以使得 miRNA 表達譜作為診斷骨肉瘤新的手段。不同的研究結果差異性表達的 miRNA 種類存在不一致的情況，但是這些特異性表達的 miRNA 在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[4,10,16,18]。雖然骨肉瘤中 miRNA 的高通量篩查結果不能直接解釋骨肉瘤的發(fā)生機理，但是能為將來研究骨肉瘤的發(fā)病機制提供很好的平臺。

此外，骨肉瘤中差異性表達的 miRNA 也可以作為新的治療靶點?；?miRNA 的治療手段為腫瘤的治療提供了新的出路，這些治療手段主要包括以下幾方面：( 1 )使用反義寡核苷酸抑制癌基因 miRNA 的表達；( 2 ) 使用miRNA 模擬物 ( miRNA mimics ) 促進抑癌基因 miRNA 的表達；( 3 ) 使用鎖定核酸技術 ( Locked nucleis acids ) 來提高 miRNA 與靶基因的親和力；( 4 ) miRNA 海綿，這種表達載體的功能等同于 miRNA 抑制劑，能夠有效降低細胞中 miRNA 的含量。miRNA 治療技術在真正應用于臨床之前，仍有一些問題需要解決，如何使作用于 miRNA 的新型治療藥物能夠具備較好的器官特異性，如何提高它們的生物利用度，如何減少副作用，以及給藥途徑的選擇等[51]。

盡管近年來，有關骨肉瘤與 miRNA 的研究層出不窮，并且也取得了一定的成果。但是我們必須意識到miRNA 與骨肉瘤的研究才剛剛開始，我們仍面臨著許多難題。盡管我們發(fā)現了多個 miRNA 與骨肉瘤相關，但是有直接證據證明 miRNA 的靶基因及其功能的 miRNA 并不多，很多的 miRNA 的功能及作用途徑仍不明確。此外miRNA 與靶基因之間的調控網絡，miRNA 之間的相互調控，miRNA 與間質干細胞分化的關系，miRNA 與骨肉瘤轉移、復發(fā)及化療敏感性的關系也是需要進一步研究的內容。

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( 本文編輯：王永剛 )

Research progress on the role of micro-ribonucleic acid in osteosarcoma

ZHAO Xiao-lei, CAI Lin, DENG Zhou-ming. Department of Orthopedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan, Hubei, 430071, PRC

Primary malignant tumors of bone are extremely rare, accounting for about 0.2% of all cancers.Osteosarcoma is the most common form of primary malignant tumors of bone and accounts for approximately 19% of all malignant tumors of bone. It is the 3rd most common malignant tumor in teenagers, after leukemia and cerebral cancer. Current treatment methods of osteosarcoma mainly include surgical resection, chemotherapy and radiotherapy. The disease-free survival rate has been escalated from ＜20% prior to the introduction of neoadjuvant chemotherapy to around 60%, and the overall survival rate reaches to 60%-70%. However, tumor metastases frequently occur, which will result in poor prognosis. The pathogenesis of osteosarcoma has not been clearly understood until now. It is important to further study the occurrence and metastasis mechanisms of osteosarcoma and continue searching for therapeutic targets for the improvement of treatment effects. During the last decade, there is a major discovery of small ribonucleic acid ( RNA ) in bioscience, including microRNA ( miRNA ). MiRNA is noncoding small RNA of 18-25 nucleotides that represses translation and cleaves messenger RNA ( mRNA ) by base-pairing to the 3’ untranslated region ( UTR ) of the target genes, so as to regulate the growth, development and differentiation of the organism. Accordingly, miRNA infuences numerous cancer-relevant processes such as proliferation, cell cycle control, apoptosis, differentiation, migration, invasion and metabolism. The expressions of most mRNAs may be regulated by miRNAs, and the cancer-related signaling pathways may be profoundly infuenced. MiRNAs can function as tumor suppressors and oncogenes. In recent years, the role of miRNA in the pathogenesis and development of osteosarcoma has been gradually revealed by the scholars. A novel approach for investigating the pathogenesis of osteosarcoma has been provided, and meanwhile new hope has been brought for the treatment of osteosarcoma.

Osteosarcoma; Gene expression regulation, neoplastic; Oncogenes; MicroRNA

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.10.012

R738.1

武漢大學研究生資助科研項目 ( 2012303020207 )；中央高校基本科研業(yè)務費專項基金資助

430071 湖北，武漢大學中南醫(yī)院骨科

蔡林，Email: guke3559@aliyun.com

2013-06-06 )