馬軍宏，侯艷婷，楊秀竹，于向陽，周振理

綜述

基于代謝組學的膿毒癥實驗研究進展

馬軍宏1,2，侯艷婷1,3，楊秀竹2，于向陽2，周振理2

膿毒癥是危重病醫(yī)學面臨的棘手難題，也是危重病人死亡的主要原因。臨床檢測具有一定的滯后性，利用代謝組學對膿毒癥患者進行早期預測，及時治療以減少其死亡率具有重要意義。

膿毒癥；代謝組學；生物標記物

膿毒癥是由感染引起的全身性炎癥反應，同時也是創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染、大手術(shù)等臨床急危重患者的嚴重并發(fā)癥之一。全球每年有超過1800萬嚴重膿毒癥病例，并且以每年1.5%～8.0%的速度上升[1]。代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后新發(fā)展起來的一門組學技術(shù)，以一組代謝物群體作為“模式標志物”來診斷疾病，可實現(xiàn)膿毒癥的早期診斷和誘因的早期鑒別，并采取有效的針對性治療，有望改善膿毒癥的預后，降低膿毒癥的病死率和醫(yī)療費用。為了更好地了解膿毒癥代謝組學研究，我們對代謝組學概念、膿毒癥發(fā)病機制及代謝組學實驗流程與應用進行概述。

1 代謝組學的概念和特點

代謝組學(metabonomics)的概念來源于代謝組。代謝組是指某一生物或細胞在一特定生理時期內(nèi)所有的低分子量代謝產(chǎn)物，代謝組學則是對這些物質(zhì)在一特定生理時期內(nèi)進行定性和定量分析的一門學科，是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后新發(fā)展起來的一門組學技術(shù)，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。它是以組群指標分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標的系統(tǒng)生物學的一個分支。

根據(jù)研究對象和目的的不同，代謝組學可分為4個層次上的研究[2]：⑴代謝物靶標分析，即某個或某幾個特定代謝組分的分析；⑵代謝輪廓分析，是對少數(shù)預設(shè)的一些代謝產(chǎn)物的定量分析，如某一類結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相關(guān)的化合物或某一代謝途徑的所有中間產(chǎn)物或多條代謝途徑的標志性組分的定量分析；⑶狹義代謝組學，是在限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量；⑷代謝物指紋分析，即不分離鑒定具體的單一組分，而是對樣品進行快速分類(如表型的快速鑒定)。

代謝組學改變了單一標志物檢驗的傳統(tǒng)思路，以一組代謝物群體作為“模式標志物”來診斷疾病。與其他組學相比，代謝組學有許多獨特的優(yōu)勢[3-4]：⑴代謝物是病理生理改變的最終結(jié)果，它調(diào)控著許多細胞內(nèi)的生命活動(如細胞信號傳導、能量傳遞等)，能更準確地反映生物體系的狀態(tài)；⑵基因和蛋白表達的微小變化會在代謝物上得到放大，檢測更容易；⑶不需要建立全基因組測序及大量表達序列標簽(EST)的數(shù)據(jù)庫，代謝組學技術(shù)也更通用，目前網(wǎng)絡資源的數(shù)據(jù)庫不下百種，例如KEGG、BioCyc包含EcoCyc和Metacyc Human Metabolome Datebase、PathDB、UM-BBD、BRENDA；⑷代謝物種類在103左右，且在各個生物體系中相類似。故問世以來，代謝組學已廣泛用于疾病診斷、藥物開發(fā)、營養(yǎng)科學、植物代謝組學和微生物代謝組學等領(lǐng)域，并取得較大的成就。

2 膿毒癥發(fā)病機制的研究

膿毒癥的發(fā)病可能與以下幾種情況有關(guān)[5]：⑴細菌內(nèi)毒素：膿毒癥病理生理過程中出現(xiàn)失控的炎性反應、免疫功能紊亂、高代謝狀態(tài)及多器官功能損害，均可由內(nèi)毒素直接或間接觸發(fā)。⑵炎癥介質(zhì)：膿毒癥中感染因素激活機體單核巨噬細胞系統(tǒng)及其他炎癥反應細胞，產(chǎn)生并釋放大量炎性介質(zhì)所致。某些細胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)-α等可能在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。⑶免疫功能紊亂：一方面是作為免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)細胞T細胞功能失調(diào)，炎癥介質(zhì)向抗炎反應漂移，致炎因子減少，抗炎因子增多；另一方面則表現(xiàn)為免疫麻痹。⑷腸道細菌/內(nèi)毒素移位：應激發(fā)生時導致的機體最大的細菌及內(nèi)毒素儲存庫-腸道發(fā)生功能失調(diào)，進而引起的腸道細菌/內(nèi)毒素移位所致感染與隨后發(fā)生的膿毒癥及多器官功能不全密切相關(guān)。⑸凝血功能紊亂：與炎癥反應相互促進構(gòu)成膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。內(nèi)毒素和TNF誘發(fā)巨噬和內(nèi)皮細胞釋放組織因子，可激活外源性凝血途徑，被激活的凝血因子進一步激活內(nèi)源性凝血途徑，最終導致彌漫性血管內(nèi)凝血。⑹基因多態(tài)性：臨床上常見受到同一致病菌感染的不同個體的臨床表現(xiàn)和預后截然不同，提示基因多態(tài)性等遺傳因素也是影響人體對應激打擊易感性與耐受性、臨床表現(xiàn)多樣性及藥物治療反應差異性的重要因素。

由此可見，膿毒癥的發(fā)病機制涉及到復雜的全身炎癥網(wǎng)絡效應、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對不同感染病原微生物及其毒素的異常反應等多個方面，與機體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)。

3 膿毒癥的臨床診斷及動物模型的建立

膿毒癥既往的診斷標準為“感染+SIRS表現(xiàn)”，但該診斷指標過于敏感。目前臨床上診斷成人膿毒癥要求有明確感染或可疑感染，加上以下指標：⑴全身發(fā)熱(>38.3℃)或低體溫(＜36℃)，心率增快(>90次/min)或>年齡正常值之上2標準差，呼吸增快(>30次/min)。意識改變，明顯水腫或液體正平衡> 20 mL/kg，持續(xù)時間超過24 h。高血糖癥(血糖>7.7mmol/L)而無糖尿病史。⑵炎癥指標。白細胞增多(>12×109/L或白細胞減少(＜4×109/L)或白細胞正常但不成熟細胞>10%，血漿C反應蛋白>正常值2個標準差，血漿降鈣素原>正常值2個標準差。⑶血流動力學指標。低血壓(收縮壓＜90 mmHg，平均動脈壓＜70 mmHg或成人收縮壓下降>40 mmHg，或低于年齡正常值之下2個標準差)?；旌响o脈血氧飽和度(SvO2)> 70%，＜90%；心臟指數(shù)(CI)>3.5 L·min-1·m-2。⑷器官功能障礙參數(shù)。氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)＜300，急性少尿(尿量＜0.5 mL· kg-1·h-1)，肌酐增加≥44.2 μmol/L，凝血功能異常(國際標準化比值>1.5或活化部分凝血活酶時間>60 s)。腸麻痹，腸鳴音消失。血小板減少(＜100×109/L)，高膽紅素血癥(總膽紅素> 70 mmol/L)。⑸組織灌注參數(shù)。高乳酸血癥(>3 mmol/L)，毛細血管再充盈時間延長或皮膚出現(xiàn)花斑。

常用的膿毒癥動物模型有：細菌或內(nèi)毒素攻擊模型，肺炎和腹膜炎模型，盲腸結(jié)扎穿模型，腹腔接種細菌模型(腹腔多種屬動物糞便接種)。其中盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)模型是模擬人類闌尾炎或憩室炎穿孔的病例，造成革蘭陰性細菌混合性感染或以革蘭陰性細菌感染為主的混合性感染，壞死組織可成為炎癥反應來源，被認為是進行膿毒癥研究的金標準[6-7]。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)模型的主要步驟為：⑴腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。⑵備皮、消毒、鋪單后，在腹部腹中線處作一2.5 cm長的切口，暴露盲腸。⑶距盲腸末端約2.5 cm處用O#絲線結(jié)扎盲腸(占盲腸總長2/3)，同時結(jié)扎盲腸腸系膜靜脈。⑷在被結(jié)扎盲腸的正中處用使用套管針(14#、18#或22#)針芯對穿盲腸兩次，在穿刺后需輕壓盲腸，擠出少量盲腸內(nèi)容物。⑸還納盲腸，4-0絲線關(guān)腹。先內(nèi)皮連續(xù)縫合，后外皮單個縫合，目的是防止大鼠咬斷縫合線造成損傷。⑹術(shù)畢，所有大鼠均皮下注射生理鹽水4 mL以補充正常的飲食、飲水。

造模成功與否，首先要對造模大鼠的死亡率進行檢測。造模大鼠隨時間的變化的死亡率，直接關(guān)系到造模大鼠能否進行有效的實驗[8]。通過改變穿孔大小、盲腸結(jié)扎程度、盲腸內(nèi)容物外流量及不同操作手法，使模型大鼠生存時間主要集中在48 h以內(nèi)，生存率約為30%～80%，為實驗提供了較理想的存活期和生存率，可較好地滿足實驗要求。要進一步檢測造模是否成功，還需要檢測更多的生理指標，以動態(tài)了解膿毒癥對大鼠肺功能、肝功能和腎功能的影響，于預設(shè)時間點(CLP術(shù)后6 h、12 h、18 h以及24 h)分別檢測了大鼠血氣分析、肝腎功及HE病理切片，術(shù)后18 h相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時HE染色切片可見中度炎癥細胞浸潤或腎小管上皮細胞壞死。因此，造模最佳采血時間點和組織切片制作時間點的選擇也很重要[9]。

4 膿毒癥代謝組學生物樣品的采集、檢測

代謝組學研究的樣本可以是生物體液樣本(尿液、血清、血漿、腦脊液、唾液等)，組織樣本勻漿(肝臟、腎臟、腦垂體、脾臟)，甚至細胞。當今代謝組學的兩大主流領(lǐng)域是metabolomics和metabonomics，前者一般以細胞做研究對象，后者則更注重于動物的體液和組織。膿毒癥代謝組學的研究主要集中在生物體液樣本，樣品多為尿液或血液，動物實驗中尿液的采集主要應用代謝籠法。

膿毒癥代謝組學的常用檢測方法為核磁共振(NMR)和液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)技術(shù)。LC/MS能鑒別和分析各類化合物及其在復雜生物樣品基質(zhì)中含量極低的代謝物類型，具有靈敏度高、結(jié)構(gòu)定性能力強、并可實現(xiàn)眾多代謝物的快速分離與分析等優(yōu)點。Lin等[10]利用H-NMR代謝組學方法，對膿毒癥大鼠進行的早期檢測。Li等[11]利用H-NMR代謝組學研究，按照中藥清熱解毒和涼血活血原則處理膿毒癥大鼠代謝的變化。該研究潛在的代謝生物標記表明：膿毒癥大鼠的多個代謝途徑發(fā)生紊亂，此項研究也證明了利用核磁共振代謝組學研究中藥藥效和機制的可行性。Liu等[12]利用UPLC-Q-TOF-MS研究熱燒傷和膿毒癥大鼠的代謝組學。Seymour等[13]利用UHPLC/MS/MS和GS/MS研究膿毒癥和肺炎的代謝組學。

5 膿毒癥代謝組學確定的生物標記物

代謝組學采集的海量數(shù)據(jù)，形成一個龐大的數(shù)據(jù)集合，需要采用化學計量學和生物信息學技術(shù)進行數(shù)據(jù)預處理和建模分析。數(shù)據(jù)預處理過程包括歸一化、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化、中心化、標準化等步驟，是后續(xù)單維和多維統(tǒng)計分析、生物標記物篩選的重要前提。多元統(tǒng)計方法有非監(jiān)督方法和監(jiān)督方法。主成分分析(PCA)是最為常用的非監(jiān)督方法，正交偏最小二乘法(OPLS)是最為常用的監(jiān)督方法，兩者同時對數(shù)據(jù)進行分析，可減少工作量并提高數(shù)據(jù)的可靠性。

膿毒癥代謝組學最早確定可用于檢測的生物標記物是C-反應蛋白，但是其專一性不高；原降鈣素比C-反應蛋白專屬性[14]、預測性更高，但是其可行度仍待研究。利用代謝組學區(qū)分膿毒癥和外周炎癥反應依舊存在困難，有關(guān)膿毒癥代謝組學生物標記物的研究仍在進行中。

Pierrakos等[15]通過查閱文獻，找到了3370多篇有關(guān)膿毒癥代謝組學的文獻，經(jīng)整理發(fā)現(xiàn)，膿毒癥已報道的生物標記物有170多個，其中18個僅在實驗中得到，58個在實驗室和臨床均可檢測到，101個僅在臨床中檢測到。在這些標記物中，目前有34個標記物已用于膿毒癥的診斷，但只有5個靈敏度和特異性超過90%。Schmerler等[14]利用靶向代謝組學，分析膿毒癥病人與外周炎癥病人的不同。該實驗采用LC-MS/MS檢測了186個代謝物，并將之分成六類(?；舛緣A、氨基酸、生物胺類、甘油磷脂、鞘磷脂、碳水化合物)，結(jié)果顯示有2個代謝物(丙三基磷脂酰膽堿、?；舛緣A)的濃度明顯高于SIRS，這有利于區(qū)分感染型和非感染性炎癥。

6 膿毒癥代謝組學應用研究

代謝組學的研究已廣泛地應用于生物學和醫(yī)學相關(guān)很多領(lǐng)域。近年來有關(guān)膿毒癥代謝組學研究也不斷增加。膿毒癥的預后評估具有相當挑戰(zhàn)性，找到一個或幾個敏感的和具體的預測標志物，在膿毒癥的早期預測中至關(guān)重要，這也是有關(guān)膿毒癥代謝組學研究的重要組成部分。有學者利用代謝組學研究給藥后膿毒癥大鼠代謝物變化，來判斷用藥是否有效，或區(qū)分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的膿毒癥的不同等。Lehmann等[16]研究服用類固醇類藥物膿毒癥大鼠的代謝組學，表明代謝物指紋分析可以用于服用類固醇類藥物膿毒癥大鼠的生物標記物的尋找，并指導類固醇類藥物對膿毒癥大鼠的治療。Kinross等[17]研究利用代謝組學研究腸菌引起的膿毒癥和多器官功能障礙綜合征，結(jié)果表明腸菌在術(shù)后膿毒癥的發(fā)展中有著重要的作用。隨著現(xiàn)代分析手段的進步和代謝物數(shù)據(jù)分析平臺的完善，有關(guān)膿毒癥代謝組學的研究必將日趨活躍，所涉及的領(lǐng)域也將更加廣泛。

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（收稿：2014-06-10 修回：2014-11-12）

（責任編輯 王 豐）

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研究涉及基金項目的標識

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R631

A

1007-6948(2014)06-0664-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.06.037

1.天津中醫(yī)藥大學（天津 300193）

2.天津市南開醫(yī)院（天津 300100）

3.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心（天津 300457）

馬軍宏，E-mail：majunhong1999@163.com