張文成，常銘洋，王韞芳，裴雪濤

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間充質(zhì)干細(xì)胞無異源/無血清培養(yǎng)基研發(fā)的現(xiàn)狀和前景

張文成，常銘洋，王韞芳，裴雪濤

100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所全軍干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/510000 廣州，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院華南干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是廣泛存在于成體骨髓、脂肪、牙髓及圍產(chǎn)期臍血、臍帶、胎盤等多種人體組織器官中，具有多向分化潛能、良好的體外擴(kuò)增能力以及免疫調(diào)節(jié)功能的成體干細(xì)胞[1]，近年來在外科燒傷[2]、軟組織填充[3]、終末期肝病[4]、心肌梗死[5]、糖尿病足[6]等疾病的治療中展現(xiàn)出良好的安全性和有效性。2011 年開始，韓國(guó) KFDA 先后批準(zhǔn)的全球首個(gè)治療急性心肌梗死的自體骨髓 MSCs 藥物Hearticellgram-AMI、治療軟骨再生的臍帶 MSCs 藥物Cartistem、治療復(fù)雜性克羅恩病并發(fā)肛瘺的自體脂肪來源 MSCs 藥物Cuepistem，以及加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)美國(guó) Osiris 公司的干細(xì)胞藥物Prochymal 的上市，是 MSCs 臨床應(yīng)用的歷史性進(jìn)步，為合理、合法、安全、有效地應(yīng)用于多種疾病的治療提供了新的契機(jī)。

在已知的眾多組織中，骨髓來源 MSCs 是研究和應(yīng)用較為充分的一種。然而，因其取材技術(shù)要求嚴(yán)格、對(duì)供體造成痛苦較大，在一定程度上限制了其應(yīng)用。近年來，脂肪、牙髓、臍帶及胎盤等組織 MSCs 分離技術(shù)的成熟，極大拓寬了 MSCs 的來源及其可能的應(yīng)用前景。其中，臍帶 MSCs 因較成年組織 MSCs 具有更低免疫原性和更強(qiáng)的體外增殖能力，在異體細(xì)胞治療中顯現(xiàn)出更為突出的優(yōu)勢(shì)。

由于組織中 MSCs 數(shù)量極其有限，為了獲得足夠用于臨床應(yīng)用的細(xì)胞量，需要在輸注前對(duì)其進(jìn)行體外擴(kuò)增。干細(xì)胞制劑制備所用的培養(yǎng)基成分除了要遵循《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》所制定的“應(yīng)有足夠的純度并符合無菌、無致病微生物及內(nèi)毒素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，殘留的培養(yǎng)基對(duì)受者應(yīng)無不良影響”的標(biāo)準(zhǔn)外，還要保證其“干性”、增殖及分化能力。盡管常規(guī)用于普通細(xì)胞培養(yǎng)的含胎牛/新生牛血清的培養(yǎng)體系同樣適合 MSCs 的體外擴(kuò)增和維持，但血清批次的不穩(wěn)定性導(dǎo)致難以避免的異源性污染及培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)殘存的動(dòng)物血清引發(fā)的免疫等問題為其臨床應(yīng)用帶來諸多隱患[7]。基于人血清或其衍生物的人源化培養(yǎng)基以及無血清培養(yǎng)基的研發(fā)和應(yīng)用為這些問題的解決提供了新的途徑和方案。

1 人源化 MSCs 培養(yǎng)基

目前已有研究嘗試?yán)米泽w血清、血漿或人外周血/臍血來源的血小板及其衍生物，如人血小板裂解物（human platelet lysate，hPL）等作為 MSCs 培養(yǎng)體系中異源性血清的替代物。自體血清無論是在倫理還是安全性方面都有一定的優(yōu)勢(shì)，但獲得的自體血清量往往不足以支持自體 MSCs 體外擴(kuò)增至臨床應(yīng)用所需的細(xì)胞數(shù)量級(jí)，而且大量采血對(duì)特殊人群造成的身體機(jī)能危害也不容忽視。Dahl 等[8]研究也證實(shí)，血清對(duì) MSCs 的支持能力會(huì)隨機(jī)體病理改變和年齡增長(zhǎng)而退減，這些問題限制了自體血清在 MSCs 體外規(guī)?；瘮U(kuò)增中的應(yīng)用。異體血清由于存在免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)、一些常規(guī)方法無法檢測(cè)的病原體污染及可能涉及到的血液制品來源及交易等問題而被禁止在 MSCs 培養(yǎng)中應(yīng)用。Lange 等[9]和 Abdelrazik 等[10]的研究證實(shí)，在添加 hPL 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增 MSCs，其成骨和脂肪誘導(dǎo)分化的能力會(huì)明顯減弱，表面特異性標(biāo)志的表達(dá)也發(fā)生改變，并由此導(dǎo)致其體外的免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用的削弱。雖然這些研究可能存在血清來源的個(gè)體差異等原因，但這些問題都是基于人源血清的培養(yǎng)基在應(yīng)用前亟待解決的問題。

2 MSCs 無血清培養(yǎng)基

對(duì) MSCs 等成體干細(xì)胞的體外多能性維持和擴(kuò)增機(jī)制研究的深入，極大推動(dòng)了 MSCs 體外無血清培養(yǎng)體系的研發(fā)和建立。2008 年，Invitrogen 公司推出第一款 MSCs 無血清培養(yǎng)基 StemPro? MSC SFM，專用于骨髓來源 MSCs 的分離培養(yǎng)。StemPro? MSC SFM 對(duì) MSCs 體外增殖具有良好的作用，而且能在相當(dāng)細(xì)胞代數(shù)內(nèi)維持 MSCs 分化的多能性，這為長(zhǎng)期以來因含血清培養(yǎng)基的使用帶來的異源性污染等問題提供了理想的解決方案。隨后R&D、Stemcell、ScienCell 等公司也先后推出了商品化的 MSCs 無血清培養(yǎng)基。

目前市售的無血清培養(yǎng)基大多包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物兩部分，有的商品化無血清培養(yǎng)基還包括促進(jìn)貼壁的明膠、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，以增加細(xì)胞的貼壁能力，提高細(xì)胞得率。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂質(zhì)、維生素、激素以及微量元素等對(duì)維持 MSCs 的生長(zhǎng)非常重要，而細(xì)胞生長(zhǎng)因子則對(duì)其多能性維持和體外增殖起到?jīng)Q定性作用。Rodrigues 等[11]對(duì)維持 MSCs 增殖和多能性的細(xì)胞生長(zhǎng)因子進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)或聯(lián)合使用TGFβ、bFGF、VEGF、HGF、EGF、PDGF 以及 Wnt 蛋白家族 Wnt3a、Wnt5a 等細(xì)胞因子，可通過激活或抑制特異的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而維持 MSCs 的增殖和多能性，這些主要的信號(hào)通路包括 Wnt、Notch、FGF 及 MAPK 信號(hào)通路（Ras-Raf-Mek1/2-Erk1/2）等。

盡管現(xiàn)有的 MSCs 無血清培養(yǎng)基不僅維持 MSCs 的體外增殖和分化多能性，而且具有批次可控和化學(xué)成分明確的特點(diǎn)，應(yīng)用中具有良好的安全性，對(duì) MSCs 臨床應(yīng)用的規(guī)范化開展產(chǎn)生了重大的積極作用，但是，大多數(shù)已有的無血清培養(yǎng)基并不足以支持原代細(xì)胞培養(yǎng)，在原代細(xì)胞分離過程中仍然需要依賴低濃度血清實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的獲取，且部分培養(yǎng)基需要對(duì)培養(yǎng)瓶/皿進(jìn)行包被以促進(jìn)細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)，從而大大增加了細(xì)胞操作過程的工作量和污染幾率。此外，由于無血清培養(yǎng)基中大多以人源化重組蛋白、微量元素和生長(zhǎng)因子的“雞尾酒”式組合實(shí)現(xiàn) MSCs 多能性的維持和體外擴(kuò)增，所以目前在售的 MSCs 無血清培養(yǎng)基均價(jià)格昂貴，保存時(shí)間有限，使得廣大干細(xì)胞研究及臨床應(yīng)用工作者望而卻步。因此，尋找成分明確、無異源性蛋白而且成本較低的無血清培養(yǎng)體系對(duì)于 MSCs 的臨床應(yīng)用具有重要的意義。

3 基于小分子化合物的新型 MSCs 無血清培養(yǎng)基

小分子化合物是一類分子量低于 900 Da 的有機(jī)化合物，通常作為酶的底物或通過與其他生物大分子結(jié)合作用于特定的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（例如，酪氨酸激酶受體等），在 DNA 復(fù)制、細(xì)胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。近年來，包括酪氨酸激酶抑制劑的一批小分子化合物藥物也投入臨床試用，證實(shí)其可以替代部分生產(chǎn)條件苛刻、服用復(fù)雜和價(jià)格昂貴的重組蛋白藥物，對(duì)腫瘤發(fā)揮靶向治療作用[12]，顯示出可觀的應(yīng)用前景。小分子化合物因其成本低、批次質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)而逐漸替換原有體系中的部分細(xì)胞生長(zhǎng)因子，被應(yīng)用于干細(xì)胞體外多能性維持和定向誘導(dǎo)分化的研究中。目前，部分小分子化合物已經(jīng)替代細(xì)胞生長(zhǎng)因子用于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化體系中，ESCs 保持了體外全能性和長(zhǎng)期擴(kuò)增及多向誘導(dǎo)分化潛能[13-15]。

初步研究表明，多種小分子化合物通過作用于 MSCs 多能性相關(guān)的信號(hào)通路而對(duì)其增殖和多能性維持發(fā)揮重要的作用。Saraswati 等[16]研究證實(shí)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑pyrvinium 可以有效提高 MSCs 的增殖并抑制其自發(fā)成骨分化能力。Heng[17]證實(shí)，在 ESCs 全能性維持中具有重要作用的 Rho 相關(guān)激酶抑制劑 Y-27632，同樣也可以有效提高 MSCs 凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率和貼壁生長(zhǎng)能力。Hong 和 Kang[18]研究表明，在 MSCs 培養(yǎng)體系中加入 4 μmol/L Hedgehog 激動(dòng)劑purmorphamine 可明顯提高 MSCs 的增殖能力，同時(shí)有效降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。雖然 TGFβ 在 MSCs 的維持中具有重要的作用，然而 Chen等[19]研究表明，使用 10 μmol/L TGFβ 抑制劑SB431542可以高效促進(jìn)胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）向 MSCs 誘導(dǎo)分化，并維持這類多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化獲得的 MSCs 的多能性和體外增殖能力。上述研究提示，小分子化合物與生長(zhǎng)因子的作用并非完全等同，作用機(jī)制也各異；此外，不同的小分子化合物之間具有協(xié)同或拮抗作用，這都是在基于小分子化合物的無血清培養(yǎng)基研發(fā)和應(yīng)用中值得注意的問題。

4 結(jié)語

MSCs 的無血清培養(yǎng)基為其安全、有效、可控地應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究提供了理想的培養(yǎng)擴(kuò)增環(huán)境。然而，目前已有的無血清培養(yǎng)基尚不完善，對(duì)其細(xì)胞致畸作用的評(píng)價(jià)及其體內(nèi)、外長(zhǎng)期的安全性評(píng)估還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，不同培養(yǎng)體系中小分子化合物的組合方案也需要進(jìn)行相應(yīng)的改良。小分子化合物較細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子更具穩(wěn)定性、批次可控性和價(jià)格優(yōu)勢(shì)，更容易實(shí)現(xiàn)真正的成分確定培養(yǎng)基的研發(fā)和推廣使用。通過高通量篩選合適的小分子化合物及其合理組合，可實(shí)現(xiàn)對(duì) MSCs 無血清培養(yǎng)基中關(guān)鍵生長(zhǎng)因子的替代和優(yōu)化，從而研發(fā)出更加安全、高效、易于質(zhì)量控制且成本低廉的 MSCs 無血清培養(yǎng)基，為 MSCs 無血清培養(yǎng)體系的建立和臨床轉(zhuǎn)化研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2013AA020109、2012AA020501）

王韞芳，Email：wangyf2011126@126.com；裴雪濤，Email：peixt@nic.bmi.ac.cn

2013-11-22

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.009