鄧雯麗 向萍 金子兵

?綜述?

多能干細胞分化來源視網(wǎng)膜色素上皮細胞移植治療視網(wǎng)膜變性研究進展

鄧雯麗 向萍 金子兵

視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）對視覺功能的維持起著至關重要的作用。視網(wǎng)膜變性是全球不可治愈性致盲疾病的重要原因，它由視網(wǎng)膜色素上皮功能失常所引起。因此，視網(wǎng)膜色素上皮移植是視網(wǎng)膜變性患者恢復視力的一種最有前景的手段之一。隨著干細胞技術的快速發(fā)展，從多能干細胞(PSC)到有功能的視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外分化誘導技術已經(jīng)成熟，其中包括胚胎干細胞（ESCs）和誘導多能干細胞(iPSCs)等。此外，從患者特異性iPSCs分化而來的RPE更能用于闡明發(fā)病機理并有針對性地個體治療。更值得一提的是，經(jīng)誘導得到RPE的移植不論在動物模型中，還是在臨床試驗里都已經(jīng)得到了可喜的治療效果。本文回顧PSC來源RPE干預治療視網(wǎng)膜變性的最新研究進展。

色素上皮，眼；胚胎干細胞；多潛能干細胞；視網(wǎng)膜變性；干細胞移植

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個重要部分，在視力的產(chǎn)生，視覺信號的處理中起著關鍵作用。視網(wǎng)膜色素上皮位于神經(jīng)視網(wǎng)膜的外層，由單層色素上皮細胞組成，其主要作用為滋養(yǎng)感光細胞，應答不同的細胞外信號，吸收分散光線，視網(wǎng)膜視覺周期異構化，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子吞噬感光細胞外節(jié)層，并作為血—視網(wǎng)膜屏障中的緊密連接部分[1-3]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmented epithelial,RPE)的缺失和功能失常是導致視網(wǎng)膜變性疾病的主要病因，包括年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）、遺傳性視網(wǎng)膜變性——視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）以及Stargardt病。這些都是世界范圍內(nèi)不可治愈性致盲疾病，遺憾的是目前仍未有根本措施能減緩這些疾病的進程，并恢復喪失視力。截止到現(xiàn)在，在視網(wǎng)膜變性治療的道路上已有很多人貢獻了自己的力量。如今，細胞移植技術是填充和置換變性受損RPE的治療策略中最有前景的一種，如其能正確整合入現(xiàn)存受損細胞網(wǎng)絡，將為治愈視網(wǎng)膜變性帶來希望。在此之前，各型RPE細胞，包括同源同體和同種異體RPE、胚胎RPE、自發(fā)人類RPE永生細胞系ARPE-19和同源同體的虹膜色素上皮等都已被用來作為移植的細胞來源。然而，遺傳易感性和移植材料的缺乏極大地限制了進一步移植的進程。

多能干細胞（pluripotent stem cells,PSCs)，包括胚胎干細胞（embryonic stem cell,ESCs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），無論從分子還是功能上都具備與體內(nèi)的PRE細胞相同的分化潛能[4-6]。更重要的是，在黃斑變性的老鼠等動物模型中已有足夠的證據(jù)說明，人類胚胎干細胞（human embroynic stem cells,hESCs）來源的RPE細胞移植能挽救感光細胞并阻止視力的進一步丟失[7-8]。2012年Schwartz等[9]報道了hESCs來源的RPE細胞能成功地移植到嚴重的視網(wǎng)膜變性疾病中。雖然關于hESCs與iPSCs的爭論從未停止，但它們都有類似的優(yōu)點，即個性化治療視網(wǎng)膜變性疾病。在本文中，將總結基于多能干細胞的發(fā)展現(xiàn)狀，概括出分化RPE細胞的不同方法，并討論支持與運輸RPE細胞的支架。

一、多能干細胞（PSCs)

PSCs是一類擁有無限增殖潛能和分化為身體任意胚層（外胚層、中胚層、內(nèi)胚層）能力的細胞。PSCs由ESCs與iPSCs組成。

Thomson以及同事成功建立了人類ESCs細胞系[10]，這激起了科學領域與社會大眾的廣泛興趣，利用其在細胞治療上的潛能可以在體外建立疾病模型，因為這樣的干細胞系能避開人類干細胞來源的缺乏問題。

iPSCs是從無干性的成體細胞如表皮細胞，通過四個轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的異位表達誘導而來，此方法最早在2006年由Takahashi和Yamanaka[11]在小鼠模型中建立。一年后他們[12]以及另一實驗小組成功將成人表皮成纖維細胞重編程為多潛能性，并證實這種hiPSCs在形態(tài)、增殖、表面抗原、基因表達、干細胞特異性狀態(tài)與端粒酶活性等與hESCs相同[13]。截止到現(xiàn)在，iPSCs在針對不同細胞類型，各種轉錄因子，不同的方法[14]上仍在探索中，其最主要的關注點是更高效，非整合，以及個體化。初始的iPSCs系相對于ES樣的克隆效率低。而如今，很多團隊都已經(jīng)報道通過各種方法增強iPSCs的分化效率，如：優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境[15-16]、降低氧濃度[17]，加入丙戊酸（組蛋白脫乙酰酶抑制劑）[18]、鋰[19]、維生素C[20]等小分子化合物。原始的iPSCs由四個關鍵轉錄因子經(jīng)病毒載體轉染而產(chǎn)生，因此，各種對于基因組的轉基因整合將導致人為的突變也限制了iPSCs的運用。緊接著，非整合性的策略顯示了其安全性，通過質(zhì)粒[21-22]或者定點整合的腺相關病毒[23]、泡沫病毒[24]、仙臺病毒[25]、PiggyBac（PB）轉座子[26]、mRNA[27]、重組蛋白[28]以及化合物[29]替代了早期病毒載體。與ESCs相比較，iPSCs能較輕易地將患者的體細胞重編程為特異性的iPSCs，它擁有與相同白細胞抗原的同源同體干細胞治療方法的不竭來源[30-31]?？偠灾?，通過非整合方法能高效地形成安全并個體化的iPSCs已逐漸成為可能。

二、RPE細胞的來源

在過去十年中，很多小組已經(jīng)持續(xù)深入地在體外從PSCs分化為RPE進行了研究，下面將詳述細節(jié)。

1.基質(zhì)細胞共培養(yǎng)：2002年Kawasaki等[32]第一次通過猴ES細胞系與基質(zhì)細胞系PA6共培養(yǎng)能夠分化出RPE樣的細胞。在培養(yǎng)3周后，擁有的大片色素細胞不但呈現(xiàn)六邊形而且標記物Pax6呈陽性，這在大約10﹪的早期ES克隆中能見到。兩年后，他們小組又報道了培養(yǎng)出的RPE細胞不僅表達典型的RPE標記物：ZO-1、RPE65、CRALBP和Mertk等，而且擁有廣泛的微絨毛能吞噬乳膠微粒。令人欣喜的是，對于RPE功能障礙的經(jīng)典模型鼠（royal college of surgeons rats，RCS）的RPE細胞視網(wǎng)膜下移植，于8周后展現(xiàn)出在保存視功能上的重要改善。2012年Okamoto等[33]發(fā)表了關于用食蟹猴的腹部皮膚在PA6的滋養(yǎng)層上（被定義為標準的SDIA法）或者在PA6上清中（改良的SDIA法）培養(yǎng)均能分化出RPE樣細胞。然而，筆者對于PA6培養(yǎng)基到底是提供了一個適合誘導的RPE細胞分化的環(huán)境，亦或是直接促成了其誘導，這其中的分子機制仍不甚清楚。

2.自發(fā)分化：自發(fā)分化的方案最早由Klimanskaya等建立。他們讓hESCs首先生長過度并層疊覆蓋后，在缺乏堿性成纖維生長因子（bFGF）的培養(yǎng)基中能被誘導自由分化為類似RPE細胞[34]。這種合成的RPE樣細胞在基因表達譜上更接近人類胚胎RPE細胞而非RPE細胞系，在移植入RCS大鼠長時間（>220 d）后，它能吞噬視桿細胞外節(jié)，有極性地分泌色素上皮因子[35]，表達ATP依賴的外轉運蛋白[36]，在劑量依賴的條件下能維持視功能與感光細胞的完整，而不形成畸胎瘤或者棘手的病理反應[7]。近期臨床研究表明hESC-RPE細胞的視網(wǎng)膜下移植安全并且耐受[9]。這份自發(fā)分化的方案同樣在誘導的iPSC分化為RPE細胞中廣泛應用[3-4,37]。hiPSCs分化出的RPE在功能缺陷的RCS老鼠視網(wǎng)膜下移植后，已被證實能促進吞噬感光細胞外節(jié)而維持其短期平衡狀態(tài)[4]。然而，有趣的是，相同條件下撤除bFGF后通過iPS出現(xiàn)產(chǎn)生色素的時間比誘導ES的平均時間明顯縮短[37]。盡管這份方案已被多個小組證實是一個從ESCs或者iPSCs分化為RPE的可信方法，但誘導成功時間仍未達成統(tǒng)一。但總而言之，當撤除生長因子后需要1 ～ 8周才能觀察到色素化的趨勢，而要出現(xiàn)足夠大的色素斑點還需要6 ～ 14周。

3.重組蛋白與化合物誘導：Osakada等[38-39]早前建立了利用重組蛋白尤其是信號通路抑制劑使PSC分化為PRE細胞的方法。在這個方案里，hESC克隆在一開始就被分離成3 ～ 10個細胞集落，接著這些集落在含有Dkk-1(Wnt信號通路抑制劑)和Lefty-A(Nodal抑制劑)的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)21 d，緊接著種到經(jīng)纖連蛋白、層黏連蛋白和單純多聚賴氨酸（PDL）包被的皿中，分化40 d后能在光學顯微鏡下觀察到色素細胞，然而，要觀察更多的色素沉著以及多邊形態(tài)需要超過60 d。分化為成熟的RPE細胞需要4個月。另一些因子如noggin(骨形態(tài)生成蛋白拮抗劑)，Shh(sonic hedgehog),胰島素樣生長因子（IGF），激活素等已被報道能誘導RPE的分化[40-41]。然而，這些重組蛋白在動物細胞或者大腸桿菌中生成，這增加了由于種屬差異帶來的感染和免疫排斥風險。另一方面，Osakada等[42]運用一種改良的方法，即化學抑制劑阻斷Wnt與Nodal信號通路，誘導hESCs和hiPSCs分化為RPE細胞。在這一方案中，小分子CKI-7（抑制酪蛋白激酶I阻斷Wnt信號通路)和SB431542（抑制激活蛋白受體樣激酶-1阻斷Nodal信號通路）分別替代了Dkk-1和Lefty-A。這樣誘導出的類RPE細胞呈現(xiàn)六邊形，表達RPE65和CRALBP,ZO-1陽性，擁有緊密連接并具備吞噬功能。此外，另外一種化合物尼克酰胺也被成功運用到hESCs到RPE細胞的分化中。這種hESC來源的RPE不僅在形態(tài)、表達標志物、功能上與真正的RPE相似，而且通過視網(wǎng)膜電圖上記錄，與13 d后才進行移植的對側眼相比，其顯著挽救了視網(wǎng)膜結構及其功能[43]。相比之下，這種通過小分子誘導hESCs和iPSCs為RPE細胞比重組蛋白有更多優(yōu)勢。因化合物有穩(wěn)定的活性，在產(chǎn)量上無差別，并且，其不存在生物源性，能確切避免感染與免疫排斥，這對基于人類多能干細胞移植的治療至關重要。

三、特異性RPE生成

從可遺傳的基因突變產(chǎn)生的iPSCs將對再生醫(yī)學產(chǎn)生重要影響[44]。這種疾病特異性的iPSCs將為研究那些缺乏適合動物模型的疾病致病機制提供空前的機會，同時這增加了疾病調(diào)查，藥物篩選，以及細胞治療的機會[45]。2011年，筆者首先建立了從五個視網(wǎng)膜色素變性患者在RP1、RP9、PRPH2或者RHO等擁有突變基因的hiPSCs[46]。其后，這些hiPSCs在體外分化為感光細胞和RPE細胞。有趣的是，這些誘導出的細胞能展現(xiàn)典型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特征，印證了疾病在體外的表型，這將幫助說明在視網(wǎng)膜色素變性中的基因突變致病機制。2012年，Baharvand小組報道了一種新型、簡便、快捷且高效的方法，能直接從有Leber’s先天性黑朦與視神經(jīng)病變，Usher綜合征，視網(wǎng)膜色素變性等的患者hiPSCs分化為RPE細胞[41]。然而上述個體化iPSCS的方法都通過逆轉錄病毒重編程。為避免逆轉錄病毒在宿主基因組中的隨機重組帶來的不可預知的副作用，筆者將非重組性的仙臺病毒載體轉入四個關鍵重編程因子（POU5F1、SOX2、KLF4、c-MYC）后，轉染入視網(wǎng)膜色素變性患者皮膚細胞中[47]，這將成為RPE移植的可能細胞來源。

四、RPE細胞的移植支架

在健康視網(wǎng)膜中，RPE是由連續(xù)的單層極性色素細胞組成的單層結構，通過介于中間的緊密連接在外部視網(wǎng)膜與脈絡膜血管中創(chuàng)建了一個屏障[37,48]。RPE移植的最終目的是盡可能恢復規(guī)律的極性，運用表面和基底部不同的蛋白，這對正常RPE的功能與維持血-視網(wǎng)膜屏障至關重要。很多研究顯示，來源于ESCs[49]和iPSCs的RPE細胞注射入RCS大鼠視網(wǎng)膜下區(qū)域后能在一定程度上挽救視功能。然而，很多分離出的細胞經(jīng)視網(wǎng)膜下或者玻璃體內(nèi)注射，表現(xiàn)得雜亂無章，不能準確定位，更有細胞從注射部位反流而出。為解決這些問題，很多支架被用來支撐RPE細胞形成擁有細胞連續(xù)性與極性的完整細胞層以進行視網(wǎng)膜下移植[50-53]。之前的報道顯示相對于視網(wǎng)膜下注射而言，支架的結合能讓移植后的細胞生存狀態(tài)和極性顯著提高[54-55]。截止到現(xiàn)在，一系列的聚合物因其生物相容性與降解性能模擬RPE細胞在細胞內(nèi)基質(zhì)的情況已被用于構建支架，其中包括天然生物材料和人造聚合物。Lu等[56]為視網(wǎng)膜上皮細胞的培養(yǎng)準備了一層薄的膠原膜支架。RPE細胞種在這些膠原膜上能形成上皮表型并且吞噬感光細胞外節(jié)。其后，另一研究組將這些在超薄膠原膜上培養(yǎng)的RPE細胞植入兔子的結膜下與視網(wǎng)膜下[53]。在移植后的16周，仍未有免疫或者排斥反應出現(xiàn)，這也展示了膠原膜在體內(nèi)的優(yōu)良生物相容性。人類RPE細胞已被證實能在其他細胞外基質(zhì)蛋白（纖連蛋白、層粘連蛋白和玻連蛋白），生物高聚物（明膠、基底膜基質(zhì)），或者組織支架（羊膜）等存活[57]。此外，最近觀察發(fā)現(xiàn)纖連蛋白-111是hESC/hiPSC-RPE細胞生長的理想基質(zhì)，即便傳數(shù)代后仍能維持穩(wěn)定性[37]。然而，因為不可避免的動物源性的污染，以及機械性能和難控制的降解率，由生物多聚物或者組織構建出連續(xù)的支架就顯得不那么現(xiàn)實。與生物材料的支架顯著不同，合成多聚物能被設計成滿足特定移植需求，并且能輕易控制降解率和機械性能[58]。實際上，一系列合成多聚物被廣泛研究以求獲得在正確定位的條理清晰的RPE細胞層。早在1996年，用低分子左旋聚乳酸（PLLA）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）制造出的厚度在（12 ± 3）μm的膜能作為人類胚胎RPE細胞的暫時基質(zhì)[59]。Lu等[60]證實了在PLGA膜上生長的人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞增長率快于組織培養(yǎng)板。如同鵝卵石般的形態(tài)與細胞表面的緊密連接這些特征都能在體外實驗中看到。緊接著，同一個研究小組用模型基質(zhì)的表面微模型化去控制RPE細胞形態(tài)，使其更先融合與表達分化的基因型[61]。Thomson與其同事發(fā)現(xiàn)，PLGA混合PLLA后更有益于人類RPE細胞基質(zhì)的形成[62]。另外，聚二甲基硅氧烷（PDMS）[63]，聚羥基丁酸戊酸酯（PHBV8）[64-65]，聚亞安酯（polyether urethanes）[66-67]，聚四氟乙烯(ePTFE)[50]等也被經(jīng)常運用。令人驚訝的是，目前仍有少量報道運用人類RPE細胞/合成支架層進行動物或者人類的視網(wǎng)膜下移植。盡管大量支架能為RPE細胞提供合適的基質(zhì)，可能會作為有規(guī)律的RPE細胞視網(wǎng)膜下移植的臨時轉運體。不過目前沒有PSCs來源的RPE與支架相互之間作用的報道。另外，仍有許多值得思考的問題留待解決：為保證細胞存活以及保持黃斑視力，理想的細胞層需要培養(yǎng)多久？如何能找到組織再生、支架降解與機械性能改變的平衡點？為了能回答這些問題，需要完成更深層次的尤其是體內(nèi)的實驗。

五、結論與展望

PSCs尤其是iPSCs的運用為生物科學以及再生醫(yī)學開辟了一條全新的道路。時至今日，很多改良后能安全有效地生成特異性iPSCs的非重組法已被建立。然而，下一步就是要建立起一個細胞系選擇金標準和有質(zhì)控的高效產(chǎn)出方法。

如今在干細胞領域的進步為體外從ES或者iPS到生成RPE細胞開辟了新路，可成為與RPE失調(diào)相關的視力退化性疾病的有效治療方法。然而，仍有很多困難需要解決。目前分化的具體流程還不能在保證效率與安全性的情況下精確到每一天，并且在移植前沒有精確的標準能夠評估功能性質(zhì)。目前，hESC來源的RPE細胞已經(jīng)預先移植到了一位進展期Stargardt’s病患者與一位年齡相關性黃斑變性的廣泛地圖樣萎縮患者中進行治療，然而，在沒有進行免疫抑制的情況下移植物能否不因組織相容分子（MHC I 和 II）外源性差異而被免疫系統(tǒng)所接收？盡管從視網(wǎng)膜變性患者的iPSCs能解決免疫排斥問題，為個體化治療的實現(xiàn)提供了可能，但當它分化為視網(wǎng)膜細胞時卻經(jīng)常出現(xiàn)功能上的缺陷。因此，在臨床移植之前精準的基因修正與徹底的評估是必備的。分化而來的RPE細胞會經(jīng)歷不同的階段（較淺的色素塊，棕色色素點，或者較深的色素塊），哪種更適合移植仍是個問題？除此之外，多種自然的或者合成的支架仍將繼續(xù)研發(fā)以支撐和運送RPE細胞，不過在組織再生、支架降解與機械性質(zhì)的平衡問題上卻很少被提及。

志 謝衷心感謝研究組每一位成員的不懈努力和實驗室中心平臺的大力支持

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The research progress toward clinical transplantation of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelial cells

Deng Wenli,Xiang Ping,Jin Zibing.Division of Ophthalmic Genetics,Laboratory for Stem Cell & Retinal Regeneration,The Eye Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Jin zibing,Email：jinzb@mail.eye.ac.cn

Retinal pigmented epithelial (RPE) cell is essential to maintain retinal function.RPE loss or dysfunction is the leading cause of incurable blindness worldwide.RPE cell replacement has been one of the most promising approaches to restore vision for these patients.With rapid progress of stem cell biology,great efforts have been made to induce functional RPE cells from pluripotent stem cells (PSCs),including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs).Disease-specific RPE cells differentiated from patient iPS cells are greatly expected to elucidate mechanism of pathogenesis and personalized therapies for retinal degenerative diseases.Additionally,transplantation of induced RPE into subretinal space has shown encouraging remedies in both animal models and clinical trials.In this review,we focus on PSC-derived RPE in field of regenerative medicine and to summarize methods for RPE cell production and delivering .

Pigment epithelium of eye；Embryonic stem cell；Pluripotent stem cells；Retinal degeneration；Stem cell transplantation；

2014-02-10)

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.004

國家重大科學研究計劃(2013CB967502)；國家自然科學基金 (81170879)

325027 溫州，溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院視網(wǎng)膜再生醫(yī)療研究組 省部共建國家重點實驗培育基地、衛(wèi)生部視覺科學重點實驗室

金子兵,Email:jinzb@mail.eye.ac.cn

鄧雯麗,向萍,金子兵.多能干細胞分化來源視網(wǎng)膜色素上皮細胞移植治療視網(wǎng)膜變性研究進展[J/CD].中華細胞與干細胞雜志:電子版,2014,4(2):97-103.