馮 韜

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所／國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心，長(zhǎng)沙410128）

油菜是我國(guó)最主要的栽培油料作物，油菜菌核病一直是威脅我國(guó)油菜生產(chǎn)的第一大病害，解決油菜菌核病威脅對(duì)保障油菜生產(chǎn)至關(guān)重要［1］。油菜菌核病是由子囊菌亞門盤菌綱柔膜菌目核盤菌科核盤菌屬的核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）所引起的一種真菌病害［2］。核盤菌強(qiáng)大的致病能力，對(duì)各種環(huán)境的高度適應(yīng)性給菌核病防控帶來(lái)極大挑戰(zhàn)，弄清楚菌核病的病理機(jī)制是解決其威脅的根本方法，對(duì)菌核病病理研究一直是科研熱點(diǎn)和難點(diǎn)。而面對(duì)油菜菌核病的巨大危害，采用合適的技術(shù)手段防止菌核病災(zāi)害的大面積發(fā)生是生產(chǎn)上的必然選擇。

1 油菜菌核病病理

核盤菌主要由菌絲通過傷口、自然孔口等薄弱部位侵入寄主，在寄主細(xì)胞間擴(kuò)布，并分泌大量水解酶及毒素使病部軟化腐爛，引發(fā)油菜菌核??；在營(yíng)養(yǎng)條件允許的情況下，可通過子囊孢子形成附著胞的方式進(jìn)入寄主。Debary［3］發(fā)現(xiàn)，只有將核盤菌子囊孢子放在加有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的寄主表面才能萌發(fā)產(chǎn)生菌絲和侵入寄主。

1.1 油菜菌核病生理病理

多種水解酶、草酸等毒素被證明與核盤菌致病性緊密相關(guān)，它們依次瓦解宿主細(xì)胞壁等防衛(wèi)體系、抑制宿主抗性反應(yīng)，達(dá)成侵染目的。

1.1.1 水解酶

細(xì)胞壁是植物重要的物理性防御屏障，在抵御真菌的過程中起著重要作用［4］。核盤菌通過分泌纖維素酶、果膠酶等水解酶瓦解宿主細(xì)胞壁對(duì)于其成功侵染寄主具有決定性作用。纖維素酶是一類葡聚糖酶的總稱，主要有外、內(nèi)切β－葡聚糖酶、β－葡萄糖苷酶等，內(nèi)、外切纖維素酶通過催化纖維素分子鏈的β－1，4－糖苷鍵水解來(lái)解聚纖維素鏈［5］，進(jìn)而造成宿主細(xì)胞壁因纖維素連接斷裂而解體。果膠酶是能水解果膠質(zhì)的一類酶的總稱，其中多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases，PG）在真菌致病中研究較多。PG分為內(nèi)切（endo PG）和外切（exo PG）兩種，能降解植物細(xì)胞壁中同源半乳糖聚糖，斷裂α－1，4－連接的D－半乳糖醛酸或半乳糖醛酸和鼠李糖殘基，進(jìn)而造成植物細(xì)胞壁降解［6］。Zafer等［7］通過含有PG抑制蛋白基因的轉(zhuǎn)基因油菜研究發(fā)現(xiàn)，抑制PG能有效延遲菌核病的發(fā)病，反向證實(shí)了PG在菌核病致病過程中的重要作用。核盤菌通過多種水解酶裂解宿主細(xì)胞壁，造成宿主感染區(qū)細(xì)胞解體，內(nèi)容物滲出形成營(yíng)養(yǎng)豐富的腐殖營(yíng)養(yǎng)基為后續(xù)的菌絲生長(zhǎng)、擴(kuò)布提供豐富的養(yǎng)分，這可能是核盤菌完成定植的先決條件。

1.1.2 草酸

早在19世紀(jì)，Debary［3］就認(rèn)為草酸是核盤菌侵染成功必不可少的。20世紀(jì)70年代，學(xué)術(shù)界陸續(xù)在核盤菌感染的各種作物中檢測(cè)出草酸的存在，并證實(shí)在侵染過程中草酸不可或缺［8，9］。Pascale等［10］、Godoy等［11］研究發(fā)現(xiàn)，核盤菌侵染過程中分泌的草酸可以調(diào)節(jié)宿主內(nèi)環(huán)境pH值并影響水解酶活性甚至?xí)绊懰饷富虮磉_(dá)，在病程中表現(xiàn)為一個(gè)高效的致病因子。劉勝毅等［12］在易感菌核病油菜中成功轉(zhuǎn)入草酸氧化酶基因，該轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)菌核病抗性顯著提升，這也從側(cè)面證實(shí)草酸在菌核病病程中的重要作用。Stephen等［13］研究草酸在菌核病病程中的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，草酸可以抑制宿主氧爆發(fā)為代表的防衛(wèi)反應(yīng)，但這種功能會(huì)受到Ca2＋的調(diào)節(jié)。90年代后發(fā)現(xiàn)草酸可以作為一種重要的非生物激發(fā)因子刺激宿主產(chǎn)生抗性反應(yīng)［14，15］。Williams等［16］研究顯示，草酸能控制宿主內(nèi)環(huán)境的氧化還原水平，從而控制宿主抗性反應(yīng)，在侵染初期，分泌高濃度的草酸，形成高度還原性環(huán)境抑制宿主氧爆發(fā)防止宿主感染區(qū)域的細(xì)胞程序性死亡，隨著侵染的加深，草酸造成的環(huán)境還原性迅速降低，促使宿主發(fā)生氧爆發(fā)，誘發(fā)宿主氧爆發(fā)區(qū)域細(xì)胞程序性死亡，形成大面積腐殖質(zhì)，從而有利于核盤菌擴(kuò)布。Mehid等［17］研究發(fā)現(xiàn)，草酸能抑制宿主細(xì)胞自噬并促進(jìn)宿主細(xì)胞的非程序性死亡，調(diào)節(jié)宿主整體的細(xì)胞凋亡狀態(tài)，達(dá)到干預(yù)宿主抗性反應(yīng)的目的。這些研究在一定程度上解釋了草酸為何能成為一種激發(fā)因子誘發(fā)宿主抗性反應(yīng)?？傮w上，現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，草酸在菌核病病害過程中主要有以下作用：降低宿主內(nèi)源pH值影響各水解酶、光合酶活性；草酸鈣形成結(jié)晶堵塞宿主導(dǎo)管等運(yùn)輸通道；螯合宿主膜性器官上的離子，改變寄主細(xì)胞膜透性，引起電解質(zhì)喪失，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)；改變宿主內(nèi)環(huán)境的氧化還原狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)宿主的防衛(wèi)反應(yīng)。

1.2 核盤菌與寄主互作機(jī)制

核盤菌通過分泌水解酶與毒素的方式侵入宿主并完成定植，但這仍無(wú)法解釋其高效的致病能力，核盤菌與宿主如何互作被用來(lái)解釋這種強(qiáng)大的致病能力，并成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

1.2.1 信號(hào)通路

病原—宿主互作中，信號(hào)產(chǎn)生、傳導(dǎo)與反饋一直是病害病理、宿主抗性機(jī)制中最重要的組成部分。MPK激酶在植物抗病中發(fā)揮著重要的信使作用［18］。劉勝毅［19］等人通過在油菜中過表達(dá) MPK4增強(qiáng)了對(duì)菌核病抗性，表明MPK激酶是誘導(dǎo)油菜抗性的重要信號(hào)。Chen等［20，21］較系統(tǒng)研究了菌核病病程中MAPK信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)cAMP可以影響菌核形成，Ras／MAPK信號(hào)通路直接調(diào)控菌核發(fā)育。Henrik等［22］研究顯示，擬南芥對(duì)核盤菌的抗性通路是茉莉酸依賴型的，而茉莉酸受體COL1并非必須的，茉莉酸在菌核病與宿主互作中可能并非唯一通路，而對(duì)于整個(gè)抗性反應(yīng)調(diào)動(dòng)卻是不可或缺的。Shi等［23］對(duì)油菜菌核病的信號(hào)傳遞研究顯示，核盤菌順序激活油菜水楊酸、茉莉酸通路完成信號(hào)傳導(dǎo)與宿主反饋，在核盤菌侵染油菜12 h之內(nèi)水楊酸途徑被激活，24 h之后茉莉酸途徑被激活，在此過程中兩種信號(hào)途徑依次開啟并相互影響。也有其他研究發(fā)現(xiàn) Ca2＋能調(diào)節(jié)草酸對(duì)宿主防衛(wèi)的抑制作用［13，24］，這可能與Ca2＋能影響鈣調(diào)蛋白激酶等信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白的活性而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)聯(lián)，但目前為止并未得到直接證實(shí)。核盤菌—油菜互作的過程中，由核盤菌造成的宿主pH值下調(diào)等生物信號(hào)直接影響蛋白激酶磷酸化誘發(fā)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響相應(yīng)基因表達(dá)，程序性進(jìn)入水楊酸與茉莉酸信號(hào)途徑，誘導(dǎo)、控制油菜的抗性反應(yīng)，但這些信號(hào)通路的分子機(jī)制并不清楚，相關(guān)的調(diào)控因子仍待發(fā)現(xiàn)和研究。

1.2.2 系統(tǒng)獲得性抗性

植物面對(duì)真菌病害只能被動(dòng)的應(yīng)對(duì)，漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中植物發(fā)展出了很多有效的免疫與生化防御手段［25］，其中系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）就是植物用來(lái)抵御非特定的真菌病害的一種重要手段。目前為止沒有發(fā)現(xiàn)油菜菌核病的有效抗原，有理由相信油菜對(duì)菌核病的抗性很大程度上來(lái)源于這種非特異的防御能力。植物體受病原侵害時(shí)，病原物無(wú)毒基因（avirulence gene，Avr）觸發(fā)的免疫（effector－triggered immunity，ETI）在局部發(fā)生，隨后ETI能引起受害植物整體產(chǎn)生一定抗性反應(yīng)即SAR。SAR與水楊酸、茉莉酸有密切關(guān)聯(lián)。在SAR中病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（non－expresser of PR1，NPR1）起核心調(diào)控作用，ETI導(dǎo)致的氧爆發(fā)造成植物內(nèi)環(huán)境強(qiáng)烈的還原勢(shì)使得NPR1寡聚蛋白還原成單體，該蛋白單體積累誘導(dǎo)水楊酸介導(dǎo)的SAR發(fā)生，同時(shí)NPR1是水楊酸、乙烯和茉莉酸介導(dǎo)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑的節(jié)點(diǎn)，這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑的強(qiáng)弱可通過NPR1這個(gè)節(jié)點(diǎn)來(lái)協(xié)調(diào)和平衡［26～29］。另外有研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子WRKY70與NPR1有相似的功能，也是植物抗病反應(yīng)中水楊酸、茉莉酸途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)［30］。對(duì)于油菜菌核病病程中油菜SAR的研究并不多，各種病程相關(guān)蛋白（pathogenesis related protein，PR）基因表達(dá)的調(diào)控等方面的研究都還是空白。SAR的研究對(duì)于弄清楚油菜對(duì)菌核病耐受性或者抗性來(lái)源有廣闊的前景。

2 油菜菌核病防治

2.1 耕作與化學(xué)防治

到目前為止油菜菌核病并未得到根治，生產(chǎn)上仍然是通過科學(xué)的農(nóng)業(yè)措施，輔以藥劑防治的綜合策略來(lái)防治菌核病。選種抗（耐）菌核病油菜、播種前對(duì)種子進(jìn)行除菌處理、與水稻、小麥等作物充分輪作、重施基肥、充分補(bǔ)充磷鉀肥防止倒伏、適當(dāng)晚播、抽薹期培土、油菜收獲后深耕等措施能有效預(yù)防菌核病爆發(fā)；藥劑防治上常在油菜盛花期使用菌核凈、多菌靈、甲基硫菌靈、速克靈等控制菌核?。?1］。

研究化學(xué)防治劑對(duì)核盤菌的滅殺機(jī)制是目前的熱點(diǎn)之一。如有人發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯與速克靈通過干預(yù)交替氧化酶的功能影響核盤菌生長(zhǎng)發(fā)育與菌核形成，達(dá)到拮抗、殺滅核盤菌的目的［32，33］。在新藥劑開發(fā)利用方面也有諸多突破。Shen等［34］研究了多種氮取代－二甲基馬來(lái)酰亞胺的人工合成以及對(duì)核盤菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這些合成的化合物可以用在生產(chǎn)上防控菌核病。另一方面，新的核盤菌生理機(jī)制發(fā)現(xiàn)為新的藥劑研發(fā)提供了很多新的思路，例如研究發(fā)現(xiàn)核盤菌的多胺生物合成對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，而一些腐胺類似物可以干擾核盤菌的多胺生物合成而抑制其生長(zhǎng)，為新型生物胺抗核盤菌藥劑研發(fā)提供了理論支持［35，36］。

2.2 生物防治

由于菌核病危害巨大，防治菌核病的化學(xué)防治劑多數(shù)成本較高，對(duì)環(huán)境危害性也較大，低利潤(rùn)率的油菜生產(chǎn)大量使用化學(xué)防治顯得很困難。為了解決防控菌核病與高成本、高風(fēng)險(xiǎn)的矛盾，新興的生物防治在菌核病防控上嶄露頭角。目前已發(fā)現(xiàn)了大量核盤菌生防菌種，其中枯草芽孢桿菌、盾殼霉、木霉等備受矚目［37～41］。這些生防菌聯(lián)合作用時(shí)通過與宿主互作激活宿主氧化應(yīng)激反應(yīng)等誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性來(lái)拮抗菌核病，多具有協(xié)同效果［42］。謝?。?3］、于曉等［44］發(fā)現(xiàn)，核盤菌突變株EP－1PN含有的特殊的真菌病毒能有效降低核盤菌致病能力，在生物防治菌核病上有很大潛力。Khalifa等［45］研究了3種核盤菌線粒體病毒的分子特性，發(fā)現(xiàn)這些病毒都屬dsRNAs，并能有效控制核盤菌。

植物次生代謝產(chǎn)物等天然生物提取物在防治菌核病上也表現(xiàn)出極大的潛力，先后從燕麥草、板狀海綿、苦楝樹等物種中獲得大量拮抗病原真菌的天然產(chǎn)物［46～48］，其中大多數(shù)對(duì)菌核病有很好的防控效果。總體來(lái)看，生物防治作為一種新興技術(shù)有很大的潛力，其在油菜菌核病的防治中也發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

3 展望

油菜菌核病是當(dāng)前我國(guó)保障油菜生產(chǎn)的最大障礙，為了保證油菜生產(chǎn)，應(yīng)從生產(chǎn)和科研方面著手控制油菜菌核病病害并逐步解決菌核病的威脅。

生產(chǎn)上，必須加大推廣各種科學(xué)防控油菜菌核病的手段，合理使用不同的藥劑和耕作方法，最大限度降低菌核病的危害。散戶是我國(guó)油菜生產(chǎn)的主力，由于油菜生產(chǎn)是一個(gè)較低利潤(rùn)的行業(yè)，各散戶并不注重病害防治，疏于管理是菌核病經(jīng)常大規(guī)模爆發(fā)的原因之一。因此加大在各大油菜產(chǎn)區(qū)的科技幫扶力度，提高農(nóng)民對(duì)油菜菌核病危害的認(rèn)識(shí)，將非常有利于防控菌核病各項(xiàng)工作的展開。

選育和利用高抗菌核病的油菜品種是對(duì)抗菌核病最有效的手段之一。自然界不乏有對(duì)菌核病高抗性的蕓薹屬植物，在油菜的抗菌核病育種上可以充分利用這些寶貴的種質(zhì)資源，一方面加強(qiáng)對(duì)潛在種質(zhì)資源的發(fā)現(xiàn)，另一方面對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的資源進(jìn)行更深的挖掘。

菌核病的病理一直是油菜抗菌核病育種遭遇的最大障礙之一，從生理、生化、分子機(jī)制等多角度闡明菌核病的病理機(jī)制是攻克菌核病需要解決的首要問題。這需要更全面的了解核盤菌各種酶和毒素的合成以及在病程中的作用，揭示核盤菌與油菜等宿主互作的機(jī)制，解釋核盤菌如何抑制油菜發(fā)生SAR在內(nèi)的各種抗性反應(yīng)。而油菜等宿主的次生代謝與菌核病等病害之間的關(guān)聯(lián)也是一個(gè)新的研究方向，植物次生代謝產(chǎn)生的各種植物毒素在抗菌核病中的作用機(jī)制以及植物毒素合成相關(guān)的基因的表達(dá)都是油菜抗菌核病育種的重要理論依據(jù)。

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