李朝暉 田 男 付 紅 李妍哲 韓 亮 田 宇

Bcl-x mRNA前體剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

李朝暉①田 男②付 紅①李妍哲①韓 亮①田 宇①

目的：探討B(tài)cl-x mRNA前體剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸（Bcl-x splice-switching oligonucleotides，Bcl-x SSO）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖和凋亡的影響。方法：設(shè)計(jì)靶向Bcl-x基因下游選擇性5'端剪接位點(diǎn)的Bcl-x SSO，β-globin SSO作為陰性對(duì)照SSO。SSO經(jīng)2'-甲氧乙基（2'-O-methoxyethyl，MOE）、全硫代磷酸化（phosphorothioate，PS）修飾。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將不同的SSO轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞。采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測(cè)Bcl-x SSO對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制率。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)U251細(xì)胞的凋亡率。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)Bcl-x SSO對(duì)Bcl-xL、Bcl-xS mRNA表達(dá)水平的影響，Western blot方法檢測(cè)Bcl-x SSO對(duì)Bcl-xL、Bcl-xS蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示Bcl-x SSO顯著抑制U251細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bcl-x SSO能夠明顯促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。RT-PCR檢測(cè)Bcl-x SSO處理組Bcl-xL mRNA表達(dá)水平下降，Bcl-xS mRNA表達(dá)水平升高。Western blot檢測(cè)Bcl-x SSO處理組Bcl-xL蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-xS蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，Bcl-x SSO可特異性的作用于Bcl-x mRNA前體，調(diào)節(jié)其選擇性剪接模式從Bcl-xL轉(zhuǎn)換至Bcl-xS，進(jìn)而促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。

選擇性剪接 寡核苷酸 凋亡 流式細(xì)胞術(shù) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞

隨著對(duì)腫瘤病因的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)多種基因mRNA前體通過(guò)選擇性剪接可產(chǎn)生兩種或多種具有不同功能的蛋白，不同選擇性剪接異構(gòu)體比值的改變與腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［1-3］。其中Bcl-x是凋亡基因Bcl-2家族成員之一，通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生抗凋亡作用的Bcl-xL和促凋亡作用的Bcl-xS兩種作用相拮抗的蛋白。Bcl-x的選擇性剪接模式在多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤中存在異常，表現(xiàn)為Bcl-xL表達(dá)水平升高，同時(shí)Bcl-xS表達(dá)水平下調(diào)［4-5］。

SSO能夠與pre-mRNA上特異的序列結(jié)合，通過(guò)封閉靶mRNA上特定的序列阻礙其中一種特定的剪接，從而調(diào)節(jié)剪接方式的轉(zhuǎn)換。針對(duì)Bcl-x基因的Bcl-x SSO被證實(shí)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)選擇性剪接，在體外和體內(nèi)均能有效抑制乳腺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤的生長(zhǎng)［6-8］。

本研究利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)Bcl-x SSO轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，特異性的封閉下游選擇性5'端剪接位點(diǎn)，將其剪接模式從Bcl-xL轉(zhuǎn)換至Bcl-xS。通過(guò)調(diào)控Bcl-x pre-mRNA選擇性剪接從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。DMEM高糖培養(yǎng)基、含EDTA胰酶購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物制品公司。MTT、DMSO購(gòu)自杭州昊天生物公司。Trizol試劑、Lipofectamine 2000試劑由美國(guó)Invitrogen公司提供。SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、Ultra SYBR購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。RIPA裂解液、兔抗人Bcl-xL、Bcl-xS抗體及抗兔二抗均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 儀器 美國(guó)Quawell超微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)SpectraMax多功能酶標(biāo)儀，德國(guó)Eppendorf PCR儀，美國(guó)Guava Easy Cyte微毛細(xì)管流式細(xì)胞分析儀，美國(guó)Aplegen OmegaLum G高分辨率凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U251細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代。

SSO合成、修飾、純化、備用。Bcl-x SSO序列為5'-TGGTTCTTACCCAGCCGCCG-3'；β-globin SSO作為陰性對(duì)照SSO（Control SSO），序列為5'-GCTAT TACCTTAACCCAG-3'。SSO均經(jīng)MOE及PS修飾。SSO由上海生工生物工程有限公司合成并純化。采用Lipofectamine 2000試劑并參照說(shuō)明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞以5×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔。待細(xì)胞增至80%～90%時(shí)，轉(zhuǎn)染不同濃度的SSO，使其終濃度分別為0、25、50、100、200、400、 800 nM（0 nM為對(duì)照組），每個(gè)濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 mg/mL的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL//孔DMSO，低速搖床10 min，使其充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)吸光度OD值。細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 濃度200 nM的Bcl-x SSO和Control SSO分別轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后48 h，收集細(xì)胞。PBS離心洗滌2次，重懸于500 μL的Binding Buffer溶液中，細(xì)胞篩過(guò)篩，加入5 μL Annexin V和5 μL PI染色液后混勻，室溫下孵育15 min，標(biāo)本用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) 濃度200 nM的Bcl-x SSO和Control SSO分別轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后48 h，Trizol試劑提取總RNA。SuperRT cDNA Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。GoldStar Best Taq DNA Polymerase擴(kuò)增Bcl-xL及Bcl-xS，分別在剪接位點(diǎn)的上游和下游設(shè)計(jì)引物。序列為∶Forward 5'-AGTAAAGCAAGCGCTGAGGGAG-3'，Reverse 5'-ACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGA-3'，擴(kuò)增片段Bcl-xL為452 bp，Bcl-xS為250 bp。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。反應(yīng)體系為50 μL，包括5× Gold Star Best Taq PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix（2.5 mM）4 μL，GoldStar Best Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，cDNA 2 μL，Primer Forward 1 μL，Primer Reverse 1 μL，添加去離子水使總體積達(dá)到50 μL。RT-PCR反應(yīng)條件∶95℃，10 min；94℃，30 s，58℃，30 s，72°C，60 s，40個(gè)循環(huán)；72°C，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，割膠分離大小不同的兩條帶，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。雙向測(cè)序，測(cè)序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 濃度200 nM的Bcl-x SSO和Control SSO分別轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后48 h，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白含量。15%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。含5%脫脂奶粉的TBS封閉，1：100稀釋的Bcl-xL和Bcl-xS兔抗人多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的抗兔IgG孵育，DAB顯色。Bcl-xL和Bcl-xS相對(duì)分子質(zhì)量分別為30 kD和21 kD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-x SSO對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用

不同濃度的Bcl-x SSO和Control SSO轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Bcl-x SSO組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞增殖抑制率隨Bcl-x SSO濃度增加而增高，呈濃度依賴性。Control SSO組細(xì)胞增殖僅受到輕度抑制，考慮為脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的損傷作用所致。Bcl-x SSO組和Control SSO組兩組之間的抑制率存在顯著性差異（P＜0.01，表1）。

2.2 Bcl-x SSO對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

各組U251細(xì)胞FITC/PI雙染結(jié)果顯示∶Bcl-x SSO組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和Control SSO組。Control SSO組細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯增加（圖1）。

2.3 Bcl-x SSO對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 Bcl-xL和Bcl-xS mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR在不同的組別均檢測(cè)到分子量大小不等的兩條條帶（圖2），電泳產(chǎn)物切膠回收純化后測(cè)序，分別和Bcl-xL（452 bp）和Bcl-xS（250 bp）的mRNA序列相符。Bcl-x SSO組與空白對(duì)照組相比，Bcl-xL mRNA表達(dá)水平下降，Bcl-xS mRNA表達(dá)水平升高，Bcl-xS/ Bcl-xL明顯增高。Control SSO組Bcl-xL和Bcl-xS mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。

2.4 Bcl-x SSO對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Bcl-x SSO組與空白對(duì)照組相比，Bcl-xL蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-xS蛋白表達(dá)水平升高。Control SSO組Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯變化（圖3）。

3 討論

mRNA選擇性剪接在真核細(xì)胞中普遍存在，被公認(rèn)為是高等生物增加蛋白質(zhì)組多樣性的主要機(jī)制。選擇性剪接受到精密的調(diào)控，在不同的組織細(xì)胞、不同的發(fā)育階段和不同的外界環(huán)境下表現(xiàn)出特定的剪接模式。選擇性剪接異?？赏ㄟ^(guò)影響腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、凋亡、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［9-11］。凋亡調(diào)控基因Bcl-x mRNA前體的選擇性剪接是目前研究最為廣泛的，Bcl-x mRNA前體通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)錄本，分別編碼Bcl-xL和Bcl-xS兩種蛋白，Bcl-xL具有抗凋亡作用，而B(niǎo)cl-xS具有促凋亡作用［4-5］。在前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中均檢測(cè)到Bcl-xL和Bcl-xS比例的失調(diào)［10-11］。

Pre-mRNA選擇性剪接產(chǎn)物比值改變的現(xiàn)象，使其成為開(kāi)發(fā)剪接模式藥物的理想靶點(diǎn)。Pre-mRNA的剪接反應(yīng)在剪接體中執(zhí)行，剪接體是由5個(gè)小分子細(xì)胞核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs）以及200多種剪接因子（splicing factor）組成的大分子復(fù)合物。SSO與腫瘤相關(guān)基因pre-mRNA上特異的序列如剪接位點(diǎn)、剪接增強(qiáng)子或剪接沉默子雜交，這種雜交阻止snRNP與該核苷酸序列結(jié)合，使剪接體從一個(gè)剪接點(diǎn)移到另一個(gè)剪接點(diǎn)，調(diào)節(jié)不同剪接方式的轉(zhuǎn)換［1-2］。

針對(duì)Bcl-x剪接設(shè)計(jì)的SSO特異性的結(jié)合Bcl-x基因內(nèi)含子2中5'端剪接位點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)Bcl-x mRNA前體的選擇性剪接，使剪接方式由Bcl-xL向Bcl-xS轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)Bcl-x SSO能夠有效抑制乳腺癌、前列腺癌及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，具有抗腫瘤活性［6-8］。本研究設(shè)計(jì)靶向Bcl-x基因內(nèi)含子2中5'端剪接位點(diǎn)的SSO，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，MTT結(jié)果顯示Bcl-x SSO對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示Bcl-x SSO能夠顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡。RT-PCR和Western blot分別從RNA和蛋白水平上證實(shí)Bcl-x SSO作用后，Bcl-xL表達(dá)下調(diào)的同時(shí)Bcl-xS的表達(dá)上調(diào)。Bcl-x SSO通過(guò)將Bcl-x的剪接模式從Bcl-xL轉(zhuǎn)換至Bcl-xS，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

SSO與傳統(tǒng)的反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，AO）和siRNA不同，傳統(tǒng)的AO與mRNA雜交后誘導(dǎo)核糖核酸酶H（ribonuclease H，RNase H）裂解靶mRNA，siRNA通過(guò)形成沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）降 解 靶mRNA。SSO并不降解靶mRNA，其通過(guò)封閉靶mRNA上特定的序列阻礙其中一種特定的剪接，從而調(diào)節(jié)剪接方式的轉(zhuǎn)換［12-13］。對(duì)SSO的要求是在細(xì)胞中具有較高的穩(wěn)定性，自身不被核酸酶降解，能夠與靶Pre-mRNA牢固的結(jié)合，同時(shí)又不激活RNase［14-15］。本研究對(duì)SSO進(jìn)行MOE、硫代磷酸化修飾。MOE修飾的寡核苷酸能夠穩(wěn)定的與靶序列形成雜交體，不會(huì)被選擇細(xì)胞內(nèi)的RNase水解，并且能進(jìn)入前體mRNA剪接所在的細(xì)胞核中。硫代磷酸化修飾能夠增加SSO的自身穩(wěn)定性。

作為一種調(diào)控機(jī)制，選擇性剪接對(duì)調(diào)控信號(hào)起到放大作用。選擇性剪接模式改變后，抗凋亡基因Bcl-xL濃度下降的同時(shí)引起促凋亡基因Bcl-xS濃度上升，使Bcl-xS/Bcl-xL比值明顯升高。而反義治療中單個(gè)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控只會(huì)引起單個(gè)基因表達(dá)水平的改變。因此，Bcl-x SSO對(duì)膠質(zhì)瘤的促凋亡效果理論上明顯高于Bcl-xL反義寡核苷酸。Bcl-x SSO有望成為膠質(zhì)瘤治療的新方法。

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（2013-12-23收稿）

（2014-02-26修回）

（本文編輯∶楊紅欣）

Apoptosis-promoting effect of splice-switching oligonucleotides targeting Bcl-x pre-mRNAof the human glioma cell line

Zhaohui LI1,Nan TIAN2,Hong FU1,Yanzhe LI1,Liang HAN1,Yu TIAN1
Correspondence to:Yu TIAN;E-mail:tianyu2801@126.com

1Department of Neurosurgery,China-Janpan Union Hospital of Jilin University,Changchun,130031,China；2Department of Cell Biology,College of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,310053,China

This work was supported by The National Natural Science Foundation of China(No.30672159),"Program for New Century Excellent Talents,"Ministry of Education of China(No.NCET-06-0306),and Jilin Provincial Science and Technology Development Plan of International Science and Technology Cooperation Projects(No.20130413028GH)

Objective:To investigate the proliferation inhibition and apoptosis-promoting effects of splice-switching oligonucleotides targeting the Bcl-x pre-mRNA(Bcl-x SSO)of the human glioma cell line U251.Methods:Bcl-x SSO was designed to bind to the 5'-splice site of exonⅡin Bcl-x pre-mRNA.An oligonucleotide targeted to aberrantly splice human β-globin intron was used as a control SSO.SSOs were modified using 2'-O-methoxyethyl and phosphorothioate,and were delivered together with lipofectamine into the human glioma cell line U251 via cationic liposomes.The proliferation inhibition rate of the cell human cell line U251 was assessed via MTT assay.Flow cytometry was performed to detect the apoptosis rate.Modulation from Bcl-xL to Bcl-xS was analyzed via reverse transcription polymerase chain reaction and Western blot.Results:The study showed that Bcl-x SSO caused proliferation inhibition and induced apoptosis in a dose-dependent manner in the human glioma cell line U251,whereas the control SSO did not show any evident effect.The expression of Bcl-xL mRNA and protein increased,whereas the expression level of Bcl-xS mRNA decreased in the human glioma cell line U251 treated with Bcl-x SSO.Conclusion:The study demonstrated that Bcl-x SSO can induce apoptosis in human glioma cell line U251.The mechanism involves the redirection of Bcl-x splicing from Bcl-xl to Bcl-xs.Bcl-x SSOs have the potential to be used as anti-cancer drugs for glioma therapy.

alternative splicing,oligonucleotides,apoptosis,flow cytometry,glioma cell line

10.3969/j.issn.1000-8179.20132178

李朝暉 博士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槟z質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)理及基因治療。

①吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科（長(zhǎng)春市130031）；②浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

*本文課題受國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30672159），教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”（編號(hào)：NCET-06-0306）及吉林省科技發(fā)展計(jì)劃國(guó)際科技合作項(xiàng)目（編號(hào)：20130413028GH）資助

田宇 tianyu2801@126.com

E-mail∶ruosong@163.com