魏熙胤 張翠翠 臧鳳琳 李 凱

肺癌患者外周血淋巴細胞亞群與預(yù)后的關(guān)系*

魏熙胤 張翠翠 臧鳳琳 李 凱

目的：探討肺癌患者外周血T細胞亞群及NK細胞與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法：回顧性觀察102例肺癌患者、12例肺良性疾病患者及23例健康體檢者，記錄其外周血T細胞亞群及NK細胞占外周血淋巴細胞的百分比，對比二者分布在肺癌、肺良性疾病及健康體檢者之間的差異，并對患者的臨床病理資料進行回顧性分析，分析淋巴細胞亞群與預(yù)后的關(guān)系及其與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：肺癌患者外周血CD4+T細胞低于健康體檢者，而CD8+T細胞卻較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；單因素分析顯示T細胞亞群及NK細胞分布與預(yù)后并無顯著關(guān)系（P＞0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤標志物等存在相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論：肺癌患者外周血T亞群及NK細胞分布異常，動態(tài)監(jiān)測患者外周血T細胞亞群及NK細胞有助于評估患者免疫功能，有望成為判斷患者預(yù)后的一種指標。

肺癌 細胞免疫 淋巴細胞亞群 預(yù)后

Department of Public Laboratory,National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Thera

py,Tianjin,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China

This work was supported by the TianjinAnticancer Special Funds for Major Scientific Projects(No.12ZCDZSY15600)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一［1］。有研究［2］表明免疫功能紊亂在其發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。其主要的效應(yīng)細胞為T細胞和NK細胞。本研究采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及NK細胞表達水平，并與良性肺疾病及健康體檢者進行對照，旨在揭示外周血T細胞亞群及NK細胞與肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2008年11月至2011年7月本院經(jīng)病理學(xué)確診、行T細胞亞群及NK細胞檢測，且隨訪資料完整的肺癌患者102例。其中男性70例，女性32例；年齡41～89歲，平均年齡（61.8±10.5）歲。其中鱗癌39例，腺癌35例，小細胞癌12例，其他16例。TNM分期∶Ⅰ期26例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期34例。入組患者均經(jīng)臨床和實驗室檢查排除免疫系統(tǒng)疾病、近期使用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素史、糖尿病及非腫瘤疾病引起的免疫缺陷。隨訪截至2013年6月，生存時間為確診之日到死亡日或隨訪截止日。收集同期住院治療并行細胞免疫檢測的肺良性疾病患者12例（其中炎性假瘤7例，結(jié)核球3例，錯構(gòu)瘤1例，感染1例）及健康體檢者23例。受試者和（或）其家屬均能理解本研究并簽署知情同意書。

1.2 方法

采用EPIC-XL型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）對肺癌、肺良性疾病及健康體檢者外周血中T細胞亞群及NK進行檢測。小鼠抗人CD3-FTIC/ CD16+56（NK）-PE、CD4-FTIC/CD8-PE雙標單克隆抗體及同型對照均購自美國貝克曼庫爾特有限公司。具體方法如下∶用5 mL肝素鈉抗凝負壓真空采血管采受試者空腹靜脈血2 mL，4 h內(nèi)進行檢測。取3個管分別標注A、B、C，取100 μL全血分別加入各管，于A管中加入20 μL同型對照，B、C管分別加入CD4/CD8、CD3/NK抗體20 μL，吹打混勻，室溫避光孵育30 min；分別加入500 μL破紅素，室溫避光20 min；各管分別加入PBS緩沖液3 mL常規(guī)清洗細胞，1 500 rpm離心5 min，棄上清；各管分別加入500 μL PBS緩沖液重懸細胞，流式細胞儀檢測。用貝克曼公司配套軟件獲取1×104個淋巴細胞，分析CD3+、CD4+、CD8+T細胞及NK細胞占淋巴細胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗數(shù)值用±s表示，驗證原始數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性后采用t檢驗或方差分析，生存資料采用Kaplan-Meier法計算生存率，Log-rank進行生存率顯著性檢驗，Cox比例回歸風(fēng)險模型進行單因素分析，評價各因素對預(yù)后的影響。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者免疫細胞的分布

本組肺癌患者免疫細胞分布分析結(jié)果（表1）顯示∶肺癌患者外周血CD4+T細胞低于健康體檢者（P= 0.008），而CD8+T細胞比例較高（P=0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CD3+T細胞比例低于健康體檢者，NK細胞較健康體檢者高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而T細胞亞群及NK細胞表達水平與肺良性疾病患者比較無顯著性差異；肺良性疾病患者與健康體檢者T細胞亞群及NK細胞表達水平亦無顯著性差異（均P＞0.05）。

2.2 預(yù)后因素分析

對所有患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置、病理類型、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、有無腫瘤家族史、T細胞亞群及NK細胞的表達、腫瘤標記物、治療方法等進行單因素分析，結(jié)果顯示∶性別、吸煙史、腫瘤位置、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、治療方式及鱗狀細胞癌相關(guān)抗原（SCC）升高是影響預(yù)后的因素。

2.3 T細胞亞群及NK細胞與臨床病理特征及腫瘤標志物的關(guān)系

根據(jù)患者的臨床病理特征進行分層，對肺癌患者外周血T細胞亞群及NK細胞數(shù)量水平進行分析。結(jié)果顯示∶無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者及TNM分期Ⅰ期患者CD4+T細胞水平顯著高于存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者及分期較晚者；而存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NK細胞卻顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；Ⅰ期患者NK細胞水平較低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；肺癌患者外周血T細胞亞群及NK細胞表達水平與腫瘤標志物亦存在相關(guān)性（表2）。

表1 肺癌患者、良性疾病及健康對照者各淋巴細胞分布 %，±sTable 1 Lymphocyte distributions in lung cancer patients，patients with benign pulmonary disease，and healthy controls %，±s

Case 102 12 23 CD3+T 68.2±13.2 68.4±11.9 69.1±4.8 60 to 80 CD4+T 35.6±12.6* 35.3±10.6 40.9±5.7 30 to 50 CD8+T 33.7±11.2* 31.2±10.2 26.3±2.9 20 to 30 NK 17.8±12.6 13.5±8.4 16.3±2.6 10 to 20 Item Lung cancer Benign pulmonary disease Healthy controls Reference value *compared with healthy controls，P＜0.05

表2 免疫細胞分布與臨床病理特征的關(guān)系 %，±sTable 2 The relationship of distribution of the immunology and clinicopathologic characteristics %，±s

Factor Nodal metastasis No Yes P Case Lymphocyte subset CD3+T CD4+T CD8+T NK 35 67 67.8±14.3 68.4±12.7 0.834 39.5±14.0 33.6±11.4 0.025 31.0±12.2 35.2±10.5 0.091 12.5±8.2 20.6±13.6＜0.001

表2 免疫細胞分布與臨床病理特征的關(guān)系 %，±s（續(xù)表2）Table 2 The relationship of distribution of the immunology and clinicopathologic characteristics %，±s

CD8+T Case Factor TNM stage Lymphocyte subset CD3+T CD4+T NKⅠⅡⅢⅣP 26 15 27 34 68.5±12.8 65.4±16.5 67.4±12.6 69.9±12.8 0.727 42.0±14.9 32.0±13.1 35.3±11.4 32.7±9.8 0.018 30.0±11.1 35.2±12.8 34.9±8.6 35.0±12.3 0.292 12.4±8.5 17.6±13.1 21.6±13.619.1±13.1 0.051 Carcinoembryonic antigen Normal Above normal P Squamous cell carcinoma Normal Above normal P Cyfra21-1 Normal Above normal P 62 36 70.7±11.9 65.3±13.0 0.039 36.1±11.8 34.6±14.0 0.584 35.0±10.7 32.5±12.2 0.296 15.8±11.3 21.2±14.3 0.038 79 19 69.7±11.7 64.7±15.3 0.119 36.0±12.2 33.4±14.2 0.412 33.8±11.5 35.3±10.4 0.605 16.3±11.3 23.7±16.3 0.021 44 54 75.8±12.1 66.3±12.4 0.030 38.9±13.0 32.8±11.6 0.016 32.2±12.1 35.6±10.4 0.136 24.6±13.2 23.5±15.2 0.695

3 討論

機體免疫功能低下或受抑制時腫瘤的發(fā)生率增高，腫瘤進行性生長時患者的免疫功能往往受抑制。不僅腫瘤的病理特征及患者所接受的治療方法影響腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，患者自身的免疫狀態(tài)也起著重要的作用［3］?？鼓[瘤免疫反應(yīng)主要是細胞免疫反應(yīng)，指經(jīng)特異性細胞（T細胞亞群）及非特異性細胞（巨噬細胞、NK細胞）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。外周血成熟的T（CD3+）細胞主要包括兩種亞群，即MHC-Ⅱ類抗原限制CD4+的Th細胞和MHC-Ⅰ類抗原限制CD8+的Ts細胞。CD4+T協(xié)調(diào)B細胞分化產(chǎn)生抗體，CD8+T則抑制抗體的合成、分泌及T細胞的增殖，兩者的穩(wěn)態(tài)維持著機體正常的免疫應(yīng)答。NK細胞在抗腫瘤免疫及限制惡性腫瘤擴散方面起著重要的作用，其來源于骨髓的大顆粒細胞，無需預(yù)先致敏即能分泌細胞毒因子殺傷腫瘤細胞［4］，能夠?qū)η址?、轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞產(chǎn)生強大的殺傷作用，從而阻止腫瘤的早期擴散。正常情況下機體T淋巴細胞及各亞群數(shù)目相對穩(wěn)定，在人體抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著重要作用。

3.1 免疫細胞分布

本組資料顯示，與健康體檢者比較，肺癌患者外周血總的T細胞（CD3+T）數(shù)量無顯著性差異，而輔助機體完成抗腫瘤免疫的輔助性T（CD4+T）細胞表達明顯降低，抑制免疫反應(yīng)及抗體形成的細胞毒性T（CD8+T）細胞卻顯著升高，高于正常參考區(qū)間上限，與其他報道相似［5-7］。而肺癌與良性肺疾病患者之間T淋巴細胞亞群及NK細胞表達水平卻未見顯著性差異；良性肺疾病患者CD4+T表達水平較健康體檢者低，CD8+T細胞稍高于健康體檢者，但差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義，與其他報道［8］不一致，這可能與本研究良性肺疾病患者較少，而且與文獻所選擇的良性疾病病種不同有關(guān)。本研究結(jié)果提示腫瘤患者機體免疫細胞分布異常，淋巴細胞各亞群間變化不平衡，進一步表明免疫功能紊亂、免疫力降低是腫瘤的發(fā)病因素之一。

3.2 預(yù)后因素

本組患者的1、2、3年生存率分別為80.4%、47.1%、23.4%，中位生存期為23個月。單因素分析結(jié)果顯示，性別、吸煙史、腫瘤位置、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、治療方式及鱗狀細胞癌相關(guān)抗原（SCC）升高是影響預(yù)后的因素，與其他報道基本一致［9］。本研究顯示性別及腫瘤位置亦為預(yù)后相關(guān)因素，考慮其原因可能為女性患者更傾向于腺癌，吸煙或既往吸煙者較少，腺癌的大體分型又多為周圍型之故。而外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T及NK細胞的表達水平卻與OS無顯著相關(guān)性，與其他報道一致［10-11］。推測其原因可能為本組患者T細胞亞群及NK細胞的表達均為治療前所測，而患者初診時的分期不同，所接受的后續(xù)治療也不同，這些差異或許弱化了淋巴細胞亞群分布與預(yù)后的關(guān)系。

3.3 免疫細胞分布與臨床病理特征的關(guān)系

為明確肺癌患者免疫細胞分布與臨床病理特征間的關(guān)系，本研究又根據(jù)性別、年齡、病理類型、腫瘤直徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等分層分析了外周血T細胞亞群及NK細胞表達情況。結(jié)果表明，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CD4+T細胞降低而CD8+T細胞升高；TNM分期為Ⅰ期者的CD4+T細胞最高而CD8+T細胞比例則較低。由此可以看出，隨疾病進展，輔助性免疫細胞不斷減少，而免疫抑制性細胞卻逐漸升高，與其他報道一致［8］。在乳腺癌等研究［12］中也得到了相似的結(jié)論。這提示隨病情進展患者淋巴細胞各亞群間的變化更不平衡、細胞免疫功能進一步被抑制，淋巴細胞各亞群的分布與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另本研究結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NK細胞比例高于無轉(zhuǎn)移者；不同TNM分期中，Ⅰ期患者NK細胞最低而Ⅲ期患者最高，與其他報道不同［13］。推測原因可能為本研究未檢測NK細胞活性，而此恰是決定腫瘤發(fā)展和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要原因。另外Eskinazi等［14］報道腫瘤細胞可產(chǎn)生可溶性因子誘導(dǎo)，引起NK細胞數(shù)量與功能相背離。莊宗杰等［15］研究亦發(fā)現(xiàn)各類型的惡性腫瘤患者NK細胞活性均低于正常人，且隨著病情進展腫瘤擴散轉(zhuǎn)移，NK細胞活性進一步降低。本研究結(jié)果還顯示不同病理類型之間各指標的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能提示T淋巴細胞亞群及NK細胞分布水平與肺癌病理類型無明顯聯(lián)系，而更與病情的嚴重程度密切相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明肺癌患者外周血T細胞亞群及NK細胞分布異常，且隨疾病的進展變化，提示免疫功能異?？赡苡绊懛伟┗颊哳A(yù)后。而免疫細胞數(shù)量與功能及其功能狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系還有待前瞻性的研究進一步證實。

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（2013-08-08收稿）

（2013-11-08修回）

（本文編輯∶邢穎）

The correlation of peripheral blood lymphocyte subsets with prognosis in lung cancer patients

Xiyin WEI,Cuicui ZHANG,Fenglin ZANG,Kai LI
Correspondence to:Kai LI;E-mail:likai5@medmail.com.cn

Objective:To study the relationship of lymphocyte subsets with prognosis and clinico-pathologic features in lung cancer patients.Methods:Flow cytometry was used to analyze the distribution of T-lymphocyte subsets and natural killer cells in the peripheral blood of lung cancer patients,patients with benign pulmonary diseases,and healthy controls.The peripheral-blood lymphocyte levels of the subjects were compared.Clinical data obtained from 102 lung cancer cases were reviewed retrospectively,and the relationship of lymphocyte subsets with prognosis and clinico-pathologic features was analyzed.Results:The level of CD4+T cells was lower in the peripheral blood of lung cancer patients than that of the healthy controls(P＜0.05);however,the level of CD8+T cells was higher in lung cancer patients than in the healthy controls(P＜0.05).Univariate analysis revealed that T-lymphocyte subsets and natural killer cells were not influential factors in the overall survival of lung cancer patients(P＞0.05).However,the abnormal distribution of lymphocyte subsets was related to lymphatic metastasis,TNM stage,and tumorigenesis P＜0.05).Conclusion:The distribution of T-lymphocyte subsets and natural killer cells was abnormal in the peripheral blood of lung cancer patients,and the dynamic changes in distribution can help assess the immune functions of lung cancer patients.Cellular immune function can act as a prognostic indicator in lung cancer patients.

lung cancer,cellular immune function,lymphocyte subsets,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20131278

魏熙胤 研究方向為流式細胞術(shù)應(yīng)用。

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所公共實驗室，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受天津市科委抗癌重大專項攻關(guān)計劃（編號：12ZCDZSY15600）資助

李凱 likai5@medmail.com.cn

E-mail∶weixiyin@126.com