鞠瑞青

對HLA-B座位中低分辨中模棱兩可基因分型的調(diào)查分析

鞠瑞青

人類白細胞抗原(HLA)是目前所知的最具有多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)之一, 它位于人類第6號染色體短臂上, 總長度3600 kb, 約占人類基因組總長度的1/3000。整個HLA復(fù)合體共有數(shù)十個基因座, 可分為HLA-Ⅰ類、HLA-Ⅱ類、HLA-Ⅲ類基因。HLA-B基因座屬于HLA-Ⅰ類基因, 它是HLA編碼系統(tǒng)中最復(fù)雜, 多態(tài)性最多的區(qū)域, 由于其高變區(qū)各個等位基因差異僅在幾個堿基, 且只有極少等位基因某個高變區(qū)具有獨立的堿基序列, 因而交叉反應(yīng)眾多, 故B位點往往出現(xiàn)定型困難［1］。盡管現(xiàn)有特異性寡核苷酸探針技術(shù)已經(jīng)達到了中等分辨水平, 但對于HLA-B座位上有些模棱兩可的基因型尚不能分辨識別。作者所在實驗室采用特異性寡核苷酸探針(PCRSSO)技術(shù)對13485例HLA-B座位進行中低分辨調(diào)查分析, 并對篩選出的模棱兩可等位基因通過采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物擴增(PCR-SSP)技術(shù)進行進一步確認。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 取自中華骨髓庫(吉林分庫)2005年～2008年入庫的造血干細胞志愿者共13485份樣本。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 儀器 PCR儀(型號分別為PE9700型、MJ PTC-200)、Luminex LABScanTM 100、紫外成像系統(tǒng)。

1.2.2 試劑 DNA提取試劑盒(gentra, 美國)、PCR-SSOP分型試劑盒(One Lambda公司)、PCR-SSP高分試劑盒(One Lambda公司)

1.3 DNA的提取 應(yīng)用快速DNA提取試劑盒(美國gentra公司)提取。

1.4 PCR-SSO檢測方法 HLA-B基因分型試劑采用PCRSSOP分型試劑盒(One Lambda公司)操作步驟見試劑說明。

1.5 PCR-SSP檢測方法 按照PCR-SSP高分試劑盒(One Lambda公司)要求操作并進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠在100 V電壓電泳10～15 min, 紫外成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

采用PCR-SSO技術(shù)檢出HLA-B座位模棱兩可204例,通過PCR-SSP方法可確認200例結(jié)果。其中B*07 座位模棱兩可共計25例, 采用的是SSP1-07 試劑, 確認結(jié)果均為(B*0702-B7;B*4801-B48);B*38/39座位模棱兩可共計25例,采用的是SSP1-16 試劑, 23例結(jié)果為(B*3802-B38;B*4001-B60), 1例結(jié)果為(B*3501-B35;B*3802-B38), 1例尚未確認;B*49/50座位模棱兩可共計18例, 采用的是SSP1-21試劑, 14例結(jié)果為(B*13-B13;B*5001-B50), 4例為(B*44-B44;B*5001-B50);B*48座位模棱兩可共計5例, 采用的是SSP1-48試劑, 5例結(jié)果均為(B*48-B48;B*55-B55);B*54-56座位模棱兩可共計93例, 采用的是 SSP1-22試劑, 其中87例結(jié)果確認為B*55基因型, 分別是(18例B*15-B62;B*55-B55, 2例B*18-B18;B*55-B55, 27例B*35-B35;B*55-B55, 3例B*37-B37;B*55-B55, 1例B*38-B38;B*55-B55, 2例B*54-B54;B*55-B55, 6例B*55-B55;B*39-B39, 27例B*55-B55;B*58-B58, 1例B*55-B55;B*67-B67), 4例結(jié)果確認為B*56基因型, 分別是(3例B*13-B13;B*56-B56, 1例B*40-B60;B*56-B56), 仍有2例需做進一步確認;B*15 座位模棱兩可共計31例, 采用的是 SSP1-15試劑, 其中 27例 (B*15-B75;B*46-B46), 3例( B*1518-B71;B*51-B51), 仍有1例需進一步確認, 其他B座位模棱兩可型采用的是Supplement試劑, 共7例均得到有效確認。

3 討論

隨著中華骨髓庫的日益壯大, 基因配型的不斷增多,HLA基因分型技術(shù)的不斷更新, 目前, 特異性寡核酸探針技術(shù)(PCR-SSO)以其靈敏度高, 特異性強等特點已被HLA基因分型實驗室廣泛應(yīng)用。但引物和探針設(shè)計存在一定的缺陷, 檢測時常會有非特異性反應(yīng)。這種非特異性交叉反應(yīng)在HLA-B基因座體現(xiàn)得尤為明顯。HLA-B基因座是目前發(fā)現(xiàn)的HLA系統(tǒng)最具有多態(tài)性的區(qū)域, 它主要集中在HLA-Ⅰ類基因的外顯子2和外顯子3中, 它們是由很多各種各樣的基元組成的, 這些基元可以被不同亞型或不同座位的等位基因同時使用, 每個等位基因的特異性是由這些基元的唯一組合而形成的, 而各種DNA水平的分型方法的探針或引物又是根據(jù)這些基元來設(shè)計的［2］。因而HLA-B基因座常常會定型困難、模棱兩可的分型結(jié)果。

作者采用特異性寡核苷酸探針(PCR-SSO)對HLA-B座位進行中低分辨調(diào)查, 發(fā)現(xiàn)在13485例樣本中, HLA-B座位模棱兩可 204例 , 其中 B*07(25例)、B*38/39(25例 )、B*49/50(18例)、B*48(5例)、B*54-56(93例)、B*15(31例)、其他(7例), 經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物擴增(PCRSSP)進一步基因確認, 可鑒定出200例結(jié)果, 仍有4例需作進一步確認。作者在對模棱兩可數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計分析時, 發(fā)現(xiàn)在辨別B*54-56一組中, 有4例B56低頻率抗原存在。B56與B55存在交叉反應(yīng), 在白種人中為0.005, 日本人中為0.01,中國人中幾乎接近于零［3］。但隨著近年來骨髓庫庫容量的不斷擴大, 以往低頻率的基因有可能不在頻率那么低, 截至到2010年12月底, 吉林省分庫中已入庫的31126份志愿者中,B*56等位基因數(shù)可達187例, 基因頻率約0.003。因此, 為確?；蚨ㄐ偷臏?zhǔn)確性, 不能忽視對HLA-B基因座模棱兩可基因的復(fù)核。同時, PCR-SSP技術(shù)可作為PCR-SSO技術(shù)的一種互補檢測技術(shù)應(yīng)用于基因定型實驗。

［1］ Arnet K L, Purham P.HLA classⅠ nucleotide sequences.Tissue Antigens, 1995, 45:217.

［2］ Robinson J, Waller MJ, Parham P, et al.IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex.Nucleic Acids Research, 2003, 31(1):311-314.

［3］ 譚建明, 周永昌, 唐孝達.組織配型技術(shù)與臨床應(yīng)用.人民衛(wèi)生出版社, 2002:33-34

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