朱登彥 張 巖 李向楠 趙 佳 趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科,河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實驗室 鄭州大學(xué)腫瘤分子外科研究所 鄭州市胸部腫瘤重點(diǎn)實驗室，河南 鄭州 450052)

促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白類激素，其基本生理功能是刺激骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放。目前臨床上主要用EPO治療腎性貧血及腫瘤等各種慢性疾患所伴發(fā)的貧血。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，EPO對肺缺血再灌注具有保護(hù)作用〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一組可調(diào)節(jié)水分子進(jìn)出細(xì)胞膜的同源蛋白質(zhì)，AQP 1的異常表達(dá)是肺缺血再灌注損傷的原因之一〔2〕。本實驗研究外源性EPO對大鼠肺缺血再灌注損傷后AQP 1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動物及主要試劑 60只河南省實驗動物中心提供的SPF級健康Wistar大鼠，雌雄不限，體重250～300 g。重組人EPO(rhEPO，江蘇宏泰生物工程制品廠)，戊巴比妥鈉注射液(上海劑三廠)、抗AQP 1多克隆抗體購自Santa Cruz公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Trizol試劑購自Invitrogen公司，AMV第1鏈合成試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，PCR試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動物模型建立 3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射肝素(100 U/kg)。仰臥位固定，氣管切開后插管，接動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣(吸入室內(nèi)空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側(cè)肺通氣8～10 ml/kg，雙側(cè)肺通氣15～20 ml/kg，吸呼比為1∶2)，經(jīng)胸骨右緣第3～5肋間開胸，離斷右肺下韌帶，游離右肺門，下穿手術(shù)線，于呼氣末結(jié)扎右肺門(右主支氣管，右肺動、靜脈)，夾閉45 min后開放120 min，制成在體肺缺血再灌注模型。

1.3實驗分組 60只大鼠隨機(jī)分為三組，每組20只。假手術(shù)組：開胸游離右肺門，無其他特殊處理。缺血再灌注組:開胸游離右肺門后，夾閉肺門阻斷45 min，再灌注120 min。EPO干預(yù)組:于術(shù)前2 h腹腔注射rhEPO(5000U/kg)〔3〕，余處理同缺血再灌注組。各組于再灌注120 min時采集標(biāo)本。

1.4檢測指標(biāo) 取部分右肺組織，濾紙吸干表面水分，測濕重，然后置70℃熱風(fēng)烘干箱烘干至恒重后測干重，肺水含量=(肺濕質(zhì)量-肺干質(zhì)量)/肺濕質(zhì)量。取右肺中葉約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小組織塊，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。余右肺組織剪切成黃豆大小的塊并迅速放入液氮罐，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，采用RT-PCR方法檢測肺組織中AQP 1 mRNA，采用免疫印跡方法測肺組織AQP 1蛋白。

1.5大鼠肺組織中AQP 1蛋白的檢測 用蛋白裂解液提取組織蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)濃度。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量50 μg，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入按1∶200稀釋的一抗，4℃下孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋度為1∶10 000)，置于37℃下孵育1 h，以增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)處理后，在暗室內(nèi)曝光X線膠片，圖像用Total Lab軟件(2.0版)進(jìn)行灰度分析。

1.6大鼠肺組織中AQP 1 mRNA表達(dá)的檢測 取肺組織，應(yīng)用Trizol試劑提取肺組織總RNA。取總RNA 2 μg，行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增AQP 1，以β-actin為內(nèi)參，每個樣本重復(fù)3次。AQP 1的上游引物為5'-TCCTGCGAGCCGTCCTGTA-3'，下游引物為5'-GGTTGTTGAAGTTGTGGGTGAG-3'，長度為354 bp。PCR反應(yīng)條件為：以94℃預(yù)變性5 min、94℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃延伸1 min為1個循環(huán)，共計28個循環(huán)，再72℃延伸5 min，最后降至4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)記錄分析，結(jié)果以相對吸光度值(A值)表示。

2 結(jié) 果

2.1大鼠肺組織AQP 1 mRNA及AQP 1蛋白的表達(dá) AQP 1 mRNA在三組肺組織的平均相對A值分別為 0.80±0.04、0.49±0.02、1.1±0.02;免疫印跡三組肺組織AQP 1蛋白表達(dá)的相對灰度分別為0.45±0.03、0.30±0.04、0.57±0.02。AQP 1 mRNA及蛋白表達(dá)水平再灌注組較假手術(shù)組降低，干預(yù)組較再灌注組、假手術(shù)組增高(P<0.05)。

2.2大鼠肺肺水含量比較 肺水含量假手術(shù)、再灌注、干預(yù)組分別為0.65±0.03、0.93±0.02、0.74±0.04。再灌注組、干預(yù)組較假手術(shù)組增高，干預(yù)組較再灌注組低(P<0.05)。

2.3鏡下病理 假手術(shù)組肺泡腔完整，肺泡間隔均勻一致，無明顯充血、水腫。再灌注組肺間質(zhì)毛細(xì)血管充血，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見血細(xì)胞滲出及滲液積聚。干預(yù)組肺泡壁略厚，間質(zhì)毛細(xì)血管充血程度降低，肺泡腔出血、滲出程度與再灌注組比較明顯減輕。

3 討 論

肺缺血再灌注損傷是一個比較常見及重要的病理生理過程，指肺組織經(jīng)歷一定時間的缺血后再給予恢復(fù)血供，缺血性損傷沒有減輕反而加重的病理現(xiàn)象。臨床主要表現(xiàn)為逐漸加重的低氧血癥、肺順應(yīng)性進(jìn)行性下降及肺間質(zhì)水腫等。AQPs 是一組與水通透性有關(guān)的同源蛋白質(zhì)大家族的總稱，AQPs 通過肺泡上皮促進(jìn)水轉(zhuǎn)運(yùn)，無論生理或病理狀態(tài)下均對呼吸系統(tǒng)的水平衡起到重要作用〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺組織AQP l 主要表達(dá)在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在大鼠肺缺血再灌注損傷過程中，AQP 1 蛋白及mRNA 表達(dá)顯著下降，提示肺水腫的形成與AQP 1表達(dá)降低有關(guān)〔2〕。

EPO是一種主要由腎臟分泌的刺激骨髓造血的糖蛋白類激素，臨床主要應(yīng)用于治療貧血。隨著研究的深入，其廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用也日益得到關(guān)注。在心臟和腎臟的缺血再灌注損傷中，EPO 表現(xiàn)出很強(qiáng)的器官保護(hù)作用〔5〕。國內(nèi)外研究顯示：EPO 主要通過與細(xì)胞膜上EPO受體結(jié)合，激活胞質(zhì)內(nèi)受體相關(guān)的蛋白酪氨酸激酶，引起EPO受體胞內(nèi)段酪氨酸殘基磷酸化及胞質(zhì)內(nèi)一系列蛋白激酶的游走和活化，通過激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而發(fā)揮器官保護(hù)作用〔6〕。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠缺血再灌注后肺組織的肺水含量增大，同時AQP 1的表達(dá)量較正常組織下降，出現(xiàn)明顯的肺水腫，說明AQP 1的表達(dá)減少與肺水腫的形成有關(guān)，AQP 1參與了大鼠肺缺血再灌注損傷水平衡的調(diào)節(jié)。外源性EPO使大鼠AQP 1 mRNA及蛋白表達(dá)水平較缺血再灌注組增加，肺水含量下降，肺水腫減輕，提示給予外源性EPO可通過增加AQP 1的表達(dá)，促進(jìn)增多的水腫液回流入血管系統(tǒng)，從而減輕肺水腫，對大鼠肺缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Moeini M,Nematbakhsh M,Fazilati M,etal. Protective role of recombinant human erythropoietin in kidney and lung injury following renal bilateral ischemia-reperfusion in rat model〔J〕. Int J Prev Med,2013;4(6): 648-55.

2Li XN,Yang JY,Pan X,etal. Influence of extract of Ginkgo biloba leaves tablets on the aquaporin-1 expression in isolated lung ischemia reperfusion〔J〕. Chin Med J,2013;126(24): 4720-3.

3Wu H,Ren B,Zhu J,etal. Pretreatment with recombined human erythropoietin attenuates ischemia-reperfusion-induced lung injury in rats〔J〕. Eur J Cardiothorac Surg,2006;29(6): 902-7.

4Perez Di Giorgio J,Soto G,Alleva K,etal.Prediction of aquaporin function by integrating evolutionary and functional analyses〔J〕. J Membr Biol,2014;247(2): 107-25.

5Li XJ,Zhang GX,Sun N,etal.Protective effects of erythropoietin on endotoxin-related organ injury in rats〔J〕. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci,2013;33(5):680-6.

6Miyake M,Goodison S,Lawton A,etal. Erythropoietin is a JAK2 and ERK1/2 effector that can promote renal tumor cell proliferation under hypoxic conditions〔J〕. J Hematol Oncol,2013;6(1):65.