李雅嘉 王 華 李強翔

(中南大學湘雅醫(yī)院眼科，湖南 長沙 410008)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，分為非增殖性DR和增殖性DR〔1,2〕。Müller細胞是一種特化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，具有維持視網(wǎng)膜正常結構、營養(yǎng)視網(wǎng)膜等多種生理功能并參與多種病理過程，如參與增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的發(fā)生〔3〕。目前多數(shù)研究證實，Müller細胞不僅起著支持和營養(yǎng)神經(jīng)元的作用，還包括維持細胞外離子的穩(wěn)定及參與谷氨酸鹽循環(huán)、突觸傳遞等作用，甚至對視覺信號的初級整合和處理也有重要的影響〔4〕。視網(wǎng)膜Müller細胞病變在DR進展中可能起著重要作用。因此，預防Müller細胞在糖尿病中的損傷應成為今后研究DR的重點。本文前期研究已發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛增強免疫抗衰老，全面修復血管、神經(jīng)、代謝、免疫等系統(tǒng)病變，對糖尿病及血管并發(fā)癥有一定的防治效果〔5〕。本文通過觀察鐵皮石斛多糖(PDC)對高糖狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞活力及凋亡的影響，探討PDC對糖尿病視網(wǎng)膜損傷是否有保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 PriCells大鼠視網(wǎng)膜müller細胞(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司提供)；細胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術研究所)；PDC，本研究組制備；低糖型DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；D-葡萄糖和胰蛋白酶粉末(美國Sigma公司)；CO2培養(yǎng)箱(武漢華海公司)；倒置生物顯微鏡(OLYMPUS 公司)；YXQ-LS-50SⅡ數(shù)顯立式蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；LDZX-40C型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器(北京六一儀器廠)；KH-600DB型數(shù)據(jù)超聲波清潔器(美國 JB/TEK 公司)；BD FACS Calibur流式細胞儀(美國BECTON DICKINSON公司)。

1.2高糖模型建立及實驗分組 Müller細胞經(jīng)培養(yǎng)及傳代，待細胞達80%融合時棄掉含血清的培養(yǎng)液，換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，再換成含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液，分別為5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L，通過12、24、36、48、72 h觀察后，確立Müller細胞高糖模型的最適糖濃度為25 mmol/L。實驗分組：(1)對照組(C組)；用10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Müller細胞48 h；(2)高糖組(HG組)：用25 mmol/L葡萄糖處理Müller細胞48 h；(3～5)不同劑量PDC組(PDC組)：用100、200和400 μg/ml PDC處理Müller細胞48 h；(6～8)高糖+不同劑量PDC組(HG + PDC)：用25 mmol/L葡萄糖和100、200、400 μg/ml PDC共同處理Müller細胞48 h。

1.3四氮唑藍比色(MTT)法檢測細胞活力。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 單細胞懸液接種于6孔板，約5×105個/孔，每孔培養(yǎng)基2 ml，培養(yǎng)12～16 h細胞貼壁后更換高糖全培養(yǎng)基及分別加入PDC共培養(yǎng)48 h。(1)移除培養(yǎng)液，1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次；(2)用不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化細胞20～30 s，輕輕吹打后移至離心管；(3)800 r/min離心5 min，1倍PBS管內(nèi)洗滌2遍；(4)分別加入200 μl的Binding Buffer吹打均勻，各組再依次加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl propidiumIodide(陰性對照組除外)，混勻后移至專用流式細胞術EP管中；(5)室溫避光反應15 min；(6)在488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長的條件下，流式細胞儀檢測每管細胞的綠光及紅光熒光強度(MFI)，以此檢測各組細胞凋亡率。

2 結 果

2.1高糖和PDC對Müller 細胞活力的影響 與對照組(0.85±0.05)比較，高糖組Müller 細胞活力(0.41±0.02)顯著降低(P<0.05)；而相同濃度的甘露醇組(1.10±0.09)與對照組比較細胞活力沒有顯著性差異(P>0.05)；鐵皮石斛(100、200、400 μg/ml)組的細胞活力(0.89±0.06、1.01±0.07、0.95±0.05)與對照組比較沒有顯著性差異(均P>0.05)。與高糖組比較，高糖+鐵皮石斛(100、200和400 μg/ml)組細胞活力(0.59±0.06、0.79±0.04、0.96±011)均顯著增加，呈現(xiàn)濃度依賴性(均P<0.05)。

2.2高糖和PDC對Müller 細胞凋亡的影響 高糖組Müller 細胞凋亡率〔(44.94±7.01)%〕與對照組〔(6.09±0.59)%〕比較顯著增加(P<0.05)；而相同濃度的甘露醇組〔(7.20±0.69)%〕與對照組比較細胞凋亡率沒有顯著性差異(P>0.05)。鐵皮石斛(100、200、400 μg/ml)組的細胞凋亡率〔(7.01±0.58)、(7.79±0.97)、(7.57±0.92)%〕與對照組比較沒有顯著性差異(均P>0.05)。高糖+鐵皮石斛(100、200、400 μg/ml)組〔(32.46±5.01)、(19.21±4.12)、(9.35±0.91)%〕與高糖組比較，鐵皮石斛以濃度依賴的方式降低了高糖誘導的細胞凋亡(均P<0.05)。

3 討 論

DR是糖尿病引起的微血管病變，可造成視功能下降及視力喪失。DR是四大主要致盲疾病之一〔6〕。DR的發(fā)病機制至今尚未完全清楚，近年來許多國內(nèi)外學者認為，Müller細胞和神經(jīng)元一神經(jīng)纖維相互關系的改變是早期DR視網(wǎng)膜功能異常的特點，Müller細胞在DR發(fā)生和發(fā)展中起重要的作用〔7〕。Müller細胞是哺乳動物視網(wǎng)膜主要神經(jīng)膠質(zhì)細胞，該細胞從內(nèi)界膜延伸到外界膜，貫穿于整個視網(wǎng)膜，最易受病理因素的影響。在DR的發(fā)病過程中，一個最重要的因素就是高糖。Müller長時間暴露于高糖環(huán)境中，細胞的超微結構發(fā)生變化，細胞器受損導致細胞功能減退〔8〕。對DR的研究多采用動物模型進行體內(nèi)實驗研究〔9〕，而在體外細胞水平研究不多，因此，利用體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞是研究增殖性視網(wǎng)膜病變的最佳途徑之一。建立視網(wǎng)膜Müller細胞體外高糖模型，在體外模擬體內(nèi)DM微環(huán)境，排除體內(nèi)其他因素的干擾，在DM病程的發(fā)生發(fā)展過程中更加直接觀察細胞的變化，這些是體內(nèi)動物實驗不能代替的。

凋亡是多細胞有機體為調(diào)控機體發(fā)育、維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞主動性死亡過程。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡失常(過度或不足)參與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展。DR的發(fā)病是多因素、多階段作用的結果，細胞凋亡在DR早期發(fā)揮重要終用。Müller細胞不僅參與視網(wǎng)膜的發(fā)育過程，而且還在維持細胞結構，營養(yǎng)神經(jīng)元、清除毒性物質(zhì)，保護神經(jīng)元、胞膜表達離子通道與受體，發(fā)揮生物學效應、表達白血病抑制因子，保護光感受器、保持視網(wǎng)膜完整和正常的生理功能等方面起到了重要的作用〔10〕。正由于視網(wǎng)膜Müller細胞在維持視網(wǎng)膜結構和功能上的重要性，研究Müller細胞在高糖的影響下其活力及凋亡的變化，對進一步了解DR的發(fā)病機制具有重要的意義。有研究表明，在高糖環(huán)境下，石斛類多糖具有對多種細胞的保護和修復作用，不僅可以抵抗鈣超載，不僅可以抑制胰島細胞凋亡和壞死、保護胰島細胞，而且對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞核轉錄因子(NF)-κB的過量表達有較好的抑制作用，對糖尿病血管病變有保護作用〔11，12〕。

本研究表明，PDC可能通過提高Müller細胞活性，減少Müller的凋亡，達到保護高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜損傷的作用。

4 參考文獻

1Robinson R，Barathi VA，Chaurasia SS，etal.Update on animal models of diabetic retinopathy：from molecular approaches to mice and higher mammals〔J〕.Dis Model Mech，2012；5(4)：444-56.

2Zhang W，Liu H，A1-Shabrawey M，etal.Inflammation and diabetic retinal microvascular complications〔J〕.J Cardiovasc Dis Res，20l1；2(2)：96-103.

3陳秀麗，過貴元.糖尿病視網(wǎng)膜Müller細胞的研究進展〔J〕.中國體視學與圖像分析，2007；12(2)：152-3.

4凌志紅，徐格致，龔紅華，等.糖尿病視網(wǎng)膜Müller細胞病理改變的體內(nèi)外研究〔J〕.眼科研究，2005；23(3)：262-5.

5高正華，楊兵勛，陳立鉆，等.鐵皮石斛的研究進展〔J〕.中國現(xiàn)代應用藥學，2008；25(22)：692-5.

6Xin H，Zhou F，Liu T,etal.Icariin ameliorates streptozotocin induced diabetic retinopathy in vitro and in vivo〔J〕.Int J Mol Sci，2012；13(1)：866-78.

7張亞潔，許紅霞，曾凱宏，等.牛磺酸對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞凋亡的防護研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學學報，2007;29(12)：1193-6.

8衛(wèi) 煊，楊建國，陳國輝.ERG 振蕩電位作為增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變預兆的探討〔J〕.眼底病，1991;7(2)：153-4.

9李冬梅，楚洪波，馬洪喜.低劑量硝酸鑭對糖尿病大鼠血清中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 和葡萄糖轉運蛋白4 蛋白表達的影響〔J〕.環(huán)境與健康雜志，2013;30(10)：872-4.

10Ozawa Y，Kurihara T，Sasaki M，etal.Neural degeneration in the retina of the streptozotocin-induced type 1 diabetes model.〔J〕.Exp Diabetes Res，2011;2011：108328.

11陳泳蓀，劉文洪.鐵皮石斛多糖提取工藝及其對高糖誘導血管內(nèi)皮細胞NF-κB 表達干預的研究〔J〕.山西中醫(yī)學院院報，2011;12(2)：27-31.

12屠國昌.鐵皮石斛的化學成分、藥理作用和臨床應用〔J〕.海峽藥學，2010;22(2)：70-1.