李琳琳，曹新志，游見明，趙迎慶

（四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

絲素蛋白中含有豐富的氨基酸，具有優(yōu)良的生物活性。但是由于絲素蛋白本身分子量較大，又不溶于水，所以其用途受到很大的限制。最新消化理論證明，一定分子量的多肽可以直接被消化道吸收，且轉(zhuǎn)運速度快，耗能較低同時還具有不易飽和的優(yōu)點，大大提高了蛋白的利用率[1]。作為高分子蛋白質(zhì)的沉淀劑，在沉淀劑使用量都過量的情況下，單寧酸能沉淀比磺基水楊酸和三氯乙酸更小的高分子蛋白質(zhì)，有文獻(xiàn)報道單寧酸能沉淀分子量為2 300 U 的蛋白質(zhì)，此外大分子蛋白質(zhì)與單寧酸溶液混合后立即產(chǎn)生沉淀[2]。離心后的上清液中含有的蛋白質(zhì)稱為酸溶性蛋白質(zhì)，只包括游離氨基酸和多肽，測定酸溶蛋白質(zhì)的總氮，扣除其中的游離氨基酸，即為多肽的含量。所以通過加入單寧酸可以將大分子蛋白質(zhì)與小分子多肽分離，且速度較快，節(jié)省測定時間，提高效率。本試驗采用單寧酸作為大分子蛋白質(zhì)的沉淀劑，結(jié)合茚三酮顯色法[3-4]和凱氏定氮儀[5-7]測定蠶絲蛋白水解液中多肽的得率。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及設(shè)備

HR-500 半自動凱氏定氮儀：上海華睿儀器有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16LG-B 冷凍離心機：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；H01-1 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；PHS-2C精密pH 計：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.2 試劑及其配制

pH 為5.4～5.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液：稱取乙酸鈉30.0 g 加1.0 mL 冰醋酸進(jìn)行溶解，并加水稀釋至250 mL，混勻，用精密pH 計測量混合緩沖液的pH，若有偏差，微調(diào)并標(biāo)定至所需pH；3%茚三酮乙醇溶液：稱取1.5 g 茚三酮，加入適量乙醇微熱溶解后，轉(zhuǎn)移至500 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，置于4 ℃冰箱中備用；丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.010 0 g丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL 容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻，置于4 ℃冰箱中備用，此溶液濃度即為100 μg/mL；0.2%抗壞血酸的配制：準(zhǔn)確稱取0.2 g 抗壞血酸，加入適量去離子水進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度；40%NaOH 溶液的配制：準(zhǔn)確稱取400 g NaOH，加入適量去離子水進(jìn)行溶解，待NaOH 完全溶解并不斷攪拌使其無色透明時，將其轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度；4%硼酸溶液的配制：準(zhǔn)確稱取40 g 硼酸，加入適量去離子水并將其放在40 ℃～50 ℃的水浴鍋中進(jìn)行溶解，待其完全溶解至溶液變成無色透明時轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度；0.01 mol/L鹽酸的配制：準(zhǔn)確量取0.45 mL 鹽酸，緩慢注入500 mL水中。（此鹽酸溶液需進(jìn)行標(biāo)定）；15%單寧酸溶液的配制：準(zhǔn)確稱取15 g 單寧酸，加適量水溶解，然后用容量瓶定容至100 mL；混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液和0.5%溴甲酚綠乙醇溶液等體積混合?；旌洗呋瘎?.2 g～0.3 g 的硫酸鉀與0.2 g～0.3 g 的五水硫酸銅混合均勻。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確抽取3.0 mL 購買的樣品液，經(jīng)離心機4000r/min離心10 min，吸取上清液1.0 mL 注入比色管中，再加入15%的單寧酸3 mL，室溫靜置沉淀10 min，用離心機4 000 r/min 離心30 min。

1.4 上清液中游離氨基酸的含量

準(zhǔn)確量取1.3 中的上清液1.0 mL 置于25 mL 比色管中，加入2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL 抗壞血酸溶液，5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加水至25 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，在568 nm 波長下比色，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的游離氨基酸含量。

1.5 上清液中多肽含量的測定

準(zhǔn)確移取1.3 中的上清液2.0 mL 加入消化管中，之后依次加入0.5 g 混合催化劑、98%的濃硫酸10 mL，打開消化爐，待消化爐的溫度升到421 ℃時計時開始，讓其消化1.0 h 后，關(guān)閉消化爐，冷卻至室溫。將消化管放入凱氏定氮儀，關(guān)上安全門，等待儀器蒸餾，蒸餾結(jié)束，取出消化管和收集氨氣的錐形瓶，之后用0.01%的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定，錐形瓶里的液體溶液由藍(lán)綠色變?yōu)槲⒓t色時為滴定終點。記錄鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積，同時測定空白值。

1.6 上清液中多肽含量的計算

式中：W 為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，（g/100 mL）；C 為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，（mol/L）；V1為空白滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL；V2為樣品消耗滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL；2 為取蠶絲水解液樣品的體積，mL；M氮為氮的摩爾質(zhì)量14.01g/mol；6.25 為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

式中：T 為多肽的含量；A 為游離氨基酸的含量。

同一樣品測定3 次，其結(jié)果的算數(shù)平均值作為最終結(jié)果，最終結(jié)果精確到小數(shù)點后兩位。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的條件選擇

2.1.1 反應(yīng)原理

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)外，其他所有的α-氨基酸都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)[8]。該反應(yīng)分兩步進(jìn)行，首先是氨基酸被氧化，產(chǎn)生CO2、NH3和醛，而水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所生成的還原型茚三酮與另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜pH為5.0～7.0，同一濃度的氨基酸在不同pH 條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色，因此要控制好pH。該反應(yīng)十分靈敏，1 ∶1 500 000 濃度的氨基酸水溶液即能顯示反應(yīng)，因此是一種常用的氨基酸定量方法。

2.1.2 波長條件的選擇

分別取丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液、樣品溶液、去離子水各1 mL于3 支試管中，甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液重復(fù)做3 次。然后在各試管中依次加入2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL抗壞血酸溶液，3.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，搖勻，置于沸水浴中加熱20 min，取出，冷卻。以去離子水為空白，在分光光度計中進(jìn)行波長掃描，測定丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液、樣品溶液的吸光度值。結(jié)果表明對照品溶液和樣品溶液在569 nm 處均有最大的吸收，因此確定本試驗的最佳測定波長為569 nm。

2.1.3 茚三酮加入量的選擇

在6 根25 mL 比色管中分別加入5.0 mL 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后在6 支比色管中依次加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 茚三酮溶液，再分別加入2.0 mL 抗壞血酸溶液和5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，加水定容至刻度，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，以去離子水為空白試驗。在569 nm 波長下測定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，結(jié)果見下圖1。

由圖1 可知，當(dāng)茚三酮加入量在1.0 mL～3.5 mL時，隨著茚三酮加入量的不斷增大，吸光度不斷增大，當(dāng)茚三酮用量為2.0 mL 時接近最大值，故茚三酮的加入量以2.0 mL 為宜。

圖1 茚三酮用量對吸光度的影響Fig.1 The effect of amount of ninhydrin on Absorbance

2.1.4 抗壞血酸溶液加入量的選擇

在6 根25 mL 比色管中分別加入5 mL 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后在6 支比色管中分別加入2.0 mL 茚三酮溶液和5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，再依次加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 抗壞血酸溶液，加水定容至刻度，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，以去離子水為空白試驗。在569 nm 波長下測定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，結(jié)果見下圖2。

圖2 抗壞血酸用量對吸光度的影響Fig.2 The effect of amount of ascorbic acid on Absorbance

由圖2 可知，當(dāng)抗壞血酸加入量在1.0 mL～3.5 mL時，隨著抗壞血酸加入量的不斷增大，吸光度不斷增大，當(dāng)抗壞血酸用量為2.0 mL 時接近最大值，故抗壞血酸的加入量以2.0 mL 為宜。

2.1.5 顯色時間的選擇

在6 根25 mL 比色管中依次分別加入5 mL 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL 抗壞血酸溶液，5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，加水定容至刻度，搖勻。置于沸水浴中分別加熱10、15、20、25、30 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，以去離子水為空白試驗。在569 nm波長下測定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，結(jié)果見下圖3。

圖3 顯色時間對吸光度的影響Fig.3 The effect of chromogenic time on Absorbance

由圖3 可知，顯色時間在10min～30min 之間時，開始時隨著顯色時間的延長吸光度不斷增大，到20 min時顯色時間達(dá)到最大，繼續(xù)延長顯色時間，吸光度基本保持在20 min 時的水平，因此，顯色時間以20 min為宜。

2.1.6 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[9-10]

在6 支25mL 的比色管中分別加入0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 的丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別加入2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL 抗壞血酸溶液，5.0 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加水至25 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色取下冷卻，定容。用紫外分光光度計在569 nm 波長條件下，于3 cm 比色皿中以試劑空白做對照，測定標(biāo)樣顯色溶液的吸光度。以丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖4。

圖4 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Stanurd curve of Amino acid

由以上標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為y=0.033 5x-0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，因此在氨基酸濃度在0～25 μg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 單寧酸沉淀蛋白質(zhì)的條件的選擇[11-13]

本試驗采用正交試驗L9（34）對15%單寧酸沉淀蛋白質(zhì)的條件進(jìn)行選擇優(yōu)化，四個因素分別是體積比，離心時間，沉淀溫度和沉淀時間。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2、表3 和表4。

通過對正交試驗結(jié)果的分析可知，對多肽得率影響最大的因素是樣液與單寧酸的體積比，其次是離心時間，而沉淀時間和沉淀溫度對多肽得率的影響都是比較小的，同時得到最優(yōu)方案為A2B2D1C1，即所選的最佳因素水平為樣液與單寧酸的體積比為1 ∶3，離心時間為30 min，沉淀時間為5 min，沉淀溫度為30 ℃。由于所選定的最優(yōu)方案不在正交試驗設(shè)計方案中，故而我們又進(jìn)一步對其進(jìn)行了驗證實驗，在此條件下得出其多肽得率為87.89%，比正交試驗表中的最佳方案A2B2D1C3所得的多肽得率86.17%高，故最終所選方案為A2B2D1C1。

表1 正交試驗的因素水平表Table 1 Factor level charts of orthogonal test

表2 正交試驗L9（34）的設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and the results of orthogonal test L9（34）

表3 試驗結(jié)果分析表Table 3 Analysis of test results

表4 正交試驗結(jié)果的方差分析（Fα=19.00，α=0.05）Table 4 Orthogonal test analysis of variance

3 結(jié)論

本試驗探索了測定蠶絲多肽含量的方法條件，為蠶絲蛋白水解液中多肽含量的測定提供更有效的方法。同時試驗結(jié)果也證明了15%單寧酸對大分子蛋白質(zhì)的沉淀時間相比較于三氯乙酸以及磺基水楊酸是很快的，其反應(yīng)時間幾乎是在瞬間就完成的，故而用單寧酸可以節(jié)省試驗時間，提高試驗效率，增加效益。

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