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      金黃色葡萄球菌三種定量檢驗(yàn)方法的比較

      2014-11-16 12:54:04劉海卿佘之蘊(yùn)陳丹玲李姣蘇妙儀張施敬王力清
      食品研究與開發(fā) 2014年13期
      關(guān)鍵詞:懸液瓊脂金黃色

      劉海卿,佘之蘊(yùn),陳丹玲,李姣,蘇妙儀,張施敬,王力清

      (廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,廣東順德528300)

      金黃色葡萄球菌(StaphyLoccocus aureus)是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一,據(jù)美國(guó)CDC報(bào)告,金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希氏菌,居第2位,占細(xì)菌性食物中毒的33%[1]。國(guó)際上一般認(rèn)為金黃色葡萄球菌≥105CFU/g就會(huì)產(chǎn)生腸毒素,發(fā)生金黃色葡萄球菌腸毒素中毒,會(huì)出現(xiàn)惡心、劇烈反復(fù)嘔吐癥狀,并伴有上腹痛及腹瀉,體溫一般不高,1 d~2 d可恢復(fù)[2]。國(guó)際食品微生物規(guī)格委員會(huì)(ICMSF)已對(duì)金黃色葡萄球菌的危害度進(jìn)行評(píng)估,將其列為中度直接局部傳播性病原菌。目前,世界各國(guó)都把金黃色葡萄球菌檢測(cè)列為食品衛(wèi)生的法定檢測(cè)項(xiàng)目[3]。

      常用金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)方法有三種:GB 4789.10-2010、SN/T 1895-2007 和 Baird-Parker瓊脂+RPF(兔血漿)快速培養(yǎng)法,這些方法各有利弊。GB 4789.10-2010實(shí)驗(yàn)步驟分四步,時(shí)間上約需78 h,SN/T 1895-2007和快速培養(yǎng)法只需一步,24 h可獲得檢測(cè)結(jié)果。本文將這3種方法對(duì)不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液進(jìn)行定量檢測(cè),進(jìn)而比較總結(jié),在不同食品污染程度時(shí),適當(dāng)選擇,對(duì)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出金葡菌含量有重要意義。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 菌株和菌懸液的制備

      金黃色葡萄球菌[ATCC 6538]。

      取-70℃條件下保存于含15%無菌丙三醇的金黃色葡萄球菌,轉(zhuǎn)種至第二代營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,用0.85%生理鹽水稀釋,制備1.0麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?,再?.85%生理鹽水梯度稀釋。

      1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

      7.5%氯化鈉肉湯;Baird-Parker平板:廣州環(huán)凱技術(shù)生物有限公司。兔血漿:青島海博生物技術(shù)有限公司。3MPerifilmTM金黃色葡萄球菌測(cè)試片:美國(guó)3M公司。Baird-Parker瓊脂+RPF(兔血漿):生物梅里埃公司。

      1.1.3 儀器設(shè)備

      高壓滅菌鍋:日本ALP。隔水式恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1 金黃色葡萄球菌國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法

      GB 4789.10-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第二法[4]。

      1.2.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法

      SN/T 1895-2007《食品中金黃色葡萄球菌的快速計(jì)數(shù)法PetrifilmTM測(cè)試片法》[5]。

      1.2.3 Baird-Parker瓊脂+RPF(兔血漿)快速培養(yǎng)法

      培養(yǎng)基配制:先將R1(Brird-Parker瓊脂)瓶中的瓊脂在100℃的水浴中約45 min溶解,將R1室溫放置至少15 s,而后將其放入45℃的水浴設(shè)備保溫,另外加10 mL室溫?zé)o菌水至R2試劑(RPF兔血漿)中,將其溶解后加入已降溫至45℃的R1,立即旋轉(zhuǎn)混勻。

      接種培養(yǎng):取每個(gè)稀釋度的菌液1 mL于無菌培養(yǎng)皿中,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿,及時(shí)將20 mL混勻后的培養(yǎng)基傾入平皿,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板,置于培養(yǎng)箱,(36±1)℃培養(yǎng)(24±2)h,結(jié)果以CFU/mL表示。

      1.2.4 三種方法比較

      三種方法檢驗(yàn)流程及典型菌落形態(tài)確認(rèn)見表1。

      表1 三種方法比較Table 1 Comparison of three kinds of test process

      1.3 統(tǒng)計(jì)方法

      所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0進(jìn)行方差分析。

      2 結(jié)果

      選用三個(gè)稀釋度的菌懸液,100CFU/mL~103CFU/mL濃度檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

      表2 三種方法檢測(cè)100CFU/mL~103CFU/mL濃度金黃色葡萄球菌懸液的結(jié)果Table 2 Results of the three methods in determining the concentrationofS.aureusintheconcentrationof100CFU/mL-103CFU/mL

      在103CFU/mL濃度時(shí)三種方法的平均值相差較大,因此增加此梯度的平行試驗(yàn),三種方法檢測(cè)103CFU/mL濃度金黃色葡萄菌懸液的10個(gè)平行結(jié)果見表3。

      表3 三種方法檢測(cè)103CFU/mL濃度金黃色葡萄球菌懸液的結(jié)果Table 3 ResuLts of the three methods in determining the concentration of S.aureus in the concentration of 103CFU/mL

      經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在103CFU/mL菌懸液濃度范圍時(shí),SN/T 1895-2007與Baird-Parker瓊脂+RPF(兔血漿)快速培養(yǎng)法結(jié)果接近(P=0.712>0.05),GB 4789.10-2010與另外兩種方法結(jié)果有顯著差異(P=0.000<0.05),另外GB 4789.10-2010的計(jì)數(shù)結(jié)果值較高。

      3 討論

      1)在低于103CFU/mL濃度時(shí)3種方法結(jié)果無明顯差異,對(duì)非仲裁檢驗(yàn)單位有十分重要的實(shí)際意義,SN/T 1895-2007方法和Baird-Parker瓊脂+RPF(兔血漿)快速培養(yǎng)法方便易行,避免了GB 4789.10-2010方法多個(gè)步驟的繁瑣環(huán)節(jié),操作簡(jiǎn)便,且檢測(cè)時(shí)間較短,便于加工企業(yè)每批樣品抽檢。但相比于GB 4789.10-2010,這兩個(gè)方法的耗材較貴,檢驗(yàn)成本較高。

      2)金黃色葡萄球菌在Baird-Parker瓊脂+RPF(兔血漿)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,陽性菌呈黑灰色,周圍沉淀環(huán)明顯,此結(jié)果易與其他形態(tài)菌落區(qū)分,結(jié)果易判讀便于計(jì)數(shù)。

      3)在實(shí)際的檢測(cè)工作中,對(duì)不同樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí),應(yīng)注意根據(jù)實(shí)際金黃色葡萄球菌污染程度選擇合適的方法,這樣既可提高檢測(cè)速度,又可確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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