1浙江省諸暨市人民醫(yī)院兒科 諸暨 311800 2浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科

3浙江省臺州中心醫(yī)院病理科

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目的觀察布地奈德對哮喘模型大鼠肺組織Toll樣受體4（TLR4）和TLR5表達(dá)的影響，探討TLR在哮喘炎癥機(jī)制中的作用。方法27只SD大鼠隨機(jī)分成哮喘組、對照組、布地奈德組，每組9只。制備哮喘大鼠模型，免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠肺組織TLR4和TLR5表達(dá)。結(jié)果哮喘組大鼠肺組織TLR4光密度值與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；布地奈德組大鼠肺組織TLR4光密度值顯著低于對照組和哮喘組（P均＜0.05）。哮喘組大鼠肺組織TLR5光密度值顯著高于對照組（P＜0.05）；布地奈德組TLR5與對照組及哮喘組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。肺組織TLR4和TLR5蛋白表達(dá)水平無相關(guān)性（r=0.246，P＞0.05）。結(jié)論OVA致敏的哮喘模型大鼠肺組織TLR5表達(dá)升高，TLR4無變化，TLR5在哮喘中可能起到促炎作用。布地奈德能下調(diào)哮喘模型大鼠肺組織TLR4和TLR5表達(dá)。

大鼠；哮喘；Toll樣受體；糖皮質(zhì)激素；免疫組織化學(xué)

“衛(wèi)生假說”認(rèn)為，哮喘患者存在Thl/Th2失衡?！靶滦l(wèi)生假說”提出，Treg細(xì)胞對Th細(xì)胞抑制功能減弱是引起哮喘發(fā)作又一重要因素[1]。而Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）與Thl/Th2失衡和Treg細(xì)胞都有密切相關(guān)[2-3]，但TLR家族各成員如何參與哮喘炎癥過程至今尚未完全清楚。不同亞型TLR所起的作用不盡相同，有些具有促炎作用，有些則反之[4]。本研究觀察布地奈德對大鼠哮喘肺組織TLR4和TLR5表達(dá)的影響，探討TLR在哮喘炎癥機(jī)制中的作用，為臨床治療哮喘提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動 物 4～5周齡清潔級健康雄性SD大鼠27只，體質(zhì)量（121±7）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，清潔級環(huán)境，自由進(jìn)食、水。

1.2藥物及試劑 布地奈德（批號LOT309973，1mg/ 2mL，阿斯利康公司生產(chǎn)）；一抗兔抗大鼠TLR3和4單克隆抗體（美國Imgenex公司）；Ⅴ級雞卵白蛋白（OVA，美國Sigma公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1分 組 27只大鼠隨機(jī)分成哮喘組、對照組、布地奈德組，每組9只。

2.2模型復(fù)制 哮喘組分別在第1天和第8天腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液｛含卵蛋白（OVA）1mg和氫氧化鋁［Al（OH）3］100mg｝2mL致敏，各1次。第15天開始每天向大鼠噴霧1%OVA 30min，連續(xù)激發(fā)7天。對照組致敏和激發(fā)階段均以生理鹽水替代OVA和Al（OH）3，布地奈德組致敏和激發(fā)方法基本同哮喘組，不同的是在每次激發(fā)前30min給予霧化吸入布地奈德溶液1mg/組。

2.3肺組織TLR4、TLR5檢測 末次激發(fā)24h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟抽血致死。取右肺組織經(jīng)4%多聚甲醛-PBS溶液固定、石蠟包埋、切片，采用免疫組化SP法測定TLR4和TLR5表達(dá)[5]。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)細(xì)支氣管，Image-pro Plus 5.1免疫組化圖像分析系統(tǒng)對陽性細(xì)胞進(jìn)行灰度掃描，取其平均值代表該片的光密度值（OD值）。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間均數(shù)比較采用Oneway ANOVA分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhame's T2檢驗(yàn)，兩因素的相關(guān)分析采用pearson分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1各組大鼠哮喘發(fā)作情況 布地奈德組大鼠死亡1只。霧化吸入OVA后，大鼠表現(xiàn)為不停搔癢、喘鳴、氣促、煩躁不安、亂竄、腹肌抽搐等癥狀。哮喘組肺組織見支氣管黏膜水腫、黏液腺增生、黏液分泌增多及黏液栓形成，部分黏膜上皮細(xì)胞脫落，支氣管壁及管腔、肺間質(zhì)、血管周圍見較多的炎性細(xì)胞浸潤。布地奈德組上述表現(xiàn)較哮喘組明顯減輕；對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，僅見少量炎癥細(xì)胞。

3.2各組大鼠肺組織TLR4表達(dá) 陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色表達(dá)，結(jié)構(gòu)清晰，著色明顯高于背景。陽性表達(dá)部位為支氣管上皮、支氣管平滑肌、血管內(nèi)皮、肺泡上皮為主，血管平滑肌呈陰性表達(dá)。哮喘組肺組織TLR4光密度值與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；布地奈德組TLR4水平顯著低于對照組和哮喘組（P均＜0.05），見表1、圖1（插頁）。

表1 各組大鼠肺組織TLR4、TLR5表達(dá)水平比較（）

表1 各組大鼠肺組織TLR4、TLR5表達(dá)水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與哮喘組比較，△P＜0.05

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3.3各組大鼠肺組織TLR5表達(dá) 陽性細(xì)胞主要為支氣管上皮、血管內(nèi)皮、肺泡上皮為主，支氣管平滑和血管平滑肌均呈陰性表達(dá)。哮喘組肺組織TLR5光密度值顯著高于對照組（P＜0.05）；布地奈德組與對照組及哮喘組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表1、圖2（插頁）。

3.4相關(guān)性分析 肺組織TLR4和TLR5蛋白的表達(dá)水平無顯著相關(guān)性（n=26，r=0.246，P＞0.05）。

4 討 論

TLR是一種模式識別受體，第一次在果繩身上被發(fā)現(xiàn)，屬于I型跨膜式識別受體，在細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞中起重要的作用，參與感染、哮喘及腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展。尤其在哮喘炎癥機(jī)制中可能起著重要的作用[6]，已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

小氣道炎癥是哮喘的主要病理機(jī)制，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞增生和炎癥細(xì)胞浸潤在哮喘的氣道炎癥中具有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4和TLR5在支氣管上皮細(xì)胞上呈陽性表達(dá)，提示支氣管上皮細(xì)胞能通過TLR4和TLR5參與哮喘的氣道炎癥過程。TLR4在支氣管平滑肌細(xì)胞也陽性表達(dá)，TLR5則呈陰性表達(dá)，提示TLR4與TLR5不同，TLR4能通過支氣管平滑肌細(xì)胞起作用。Mansson等[7]也證實(shí)支氣管平滑肌細(xì)胞能表達(dá)TLR4，其激動劑能誘導(dǎo)它增加分泌炎癥因子IL-6、IL-8等，提示支氣管平滑肌細(xì)胞能通過TLR4達(dá)到致炎的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肺組織TLR4表達(dá)水平在哮喘組與對照組無差別（P＞0.05），可能與TLR4是脂多糖配體而對OVA刺激不敏感有關(guān)，與蘇苗賞等[8]研究結(jié)果相近。而在屋塵螨致敏的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TLR4在支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞上表達(dá)增加，認(rèn)為它具為促炎的作用，屋塵螨可能是它的主要刺激物之一[9]。哮喘組肺組織TLR5表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），提示TLR5在哮喘的氣道炎癥中可能起促炎作用。相似的研究發(fā)現(xiàn)，TLR5在氣道上皮細(xì)胞上呈高表達(dá)而在肺泡巨噬細(xì)胞呈弱表達(dá)，且在TLR5基因敲除的小鼠經(jīng)屋塵致敏后發(fā)現(xiàn)，嗜酸細(xì)胞的水平顯著低于TLR4基因敲除組，證實(shí)TLR5具有促進(jìn)哮喘氣道高反應(yīng)性的作用[10]。在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中也發(fā)現(xiàn)TLR5表達(dá)水平升高，且與TNF-α水平顯著正相關(guān)，證實(shí)TLR5是一種促炎的炎癥介質(zhì)[11]。

霧化吸入布地奈德是目前治療哮喘的首選藥物，具有安全和全身性副作用少等特點(diǎn)，已在臨床廣泛得到應(yīng)用。我科既往研究也發(fā)現(xiàn)，布地奈德具有抑制哮喘炎癥的作用[12]，但其機(jī)制至今尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，布地奈德組TLR4表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05），提示它能下調(diào)肺組織TLR4表達(dá)。本結(jié)果與蘇苗賞[8]的研究結(jié)果相反，但與韋江紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能下調(diào)肺組織TLR4表達(dá)改善氣道重塑的結(jié)果相似。而布地奈德組TLR5表達(dá)水平與哮喘組及對照組均無差別，提示布地奈德有下調(diào)TLR5的趨勢。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，TLR4和TLR5在肺組織中的表達(dá)水平無內(nèi)在相關(guān)性（P＞0.05）。

綜上所述，OVA致敏的哮喘大鼠肺組織TLR5表達(dá)升高，TLR4無變化，TLR5在哮喘的炎癥中可能起促炎作用。布地奈德能下調(diào)TLR4和TLR5的表達(dá)，其抗炎作用可能通過下調(diào)TLR4和TLR5的途徑。本研究存在的不足之處是，實(shí)驗(yàn)中樣本量偏少，且雖然動物實(shí)驗(yàn)較人體容易獲得肺組織，但與人類并不完全相同。如要準(zhǔn)確、全面評估布地奈德對哮喘患者TLR4和TLR5表達(dá)的影響，仍需要對哮喘患者進(jìn)行大樣本、隨機(jī)對照研究。

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布地奈德對哮喘模型大鼠肺組織Toll樣受體4和5表達(dá)的影響

方 麗1陳培英1童夏生2范廣民3王恩智2

Effect of Budesonide on the Expression of Toll-like Receptor 4 and 5 in Rat Asthma Model

FANG Li1，CHEN Peiying1，TONG Xiasheng2，F(xiàn)AN Guangming3，WANG Enzhi2.1 Department of Pediatrics,People's Hospital of Zhuji,Shaoxing (311800),China;2 Department of Pediatrics,Taizhou Integrated Traditional and Western Medicine Hospital;3 Department of Pathology,Zhejiang Taizhou Central Hospital.

ObjectiveTo investigate the effect of budesonide on the expression of Toll-like receptor（TLR）4 and 5 in asthma rats and the potential roles of TLR in pathogenesis of asthma inflammation.MethodsTwentyseven SD rats were randomly divided into three groups：asthma group，control group，and budesonide group.The rat model of asthma was established with injection of OVA.The expressions of TLR4 and TLR5 proteins were detected by immunohistochemical method.ResultsNo significant difference in TLR4 expression in lung tissue was noted between asthma group and control group（P＞0.05）.The level of TLR 4 in budesonide group was significantly lower than that in control group and asthma group（Ps＜0.05）.The expression of TLR5 in lung tissue in asthma group was dramatically higher than that in control group（P＜0.05），while it did not differ between budesonide group and control group or asthma group（Ps＞0.05）.No correlation between the levels of TLR4 and TLR5 in lung tissue was found（r=0.246，P＞0.05）.ConclusionIn OVA challenged asthmatic lung tissue，the level of TLR5 was elevated，while the level of TLR4 did not change，indicating that TLR5 may be as a inflammation-promoting mediator in asthma exacerbation.Budesonide can down-regulate the levels of TLR4 and TLR5.

rats；asthma；Toll like receptor；glucocorticoid；immunohistochemistry

浙江省溫嶺市科技局基金資助項(xiàng)目（No.2009-2-55）

童夏生，E-mail：xshtzg37@163.com

2013-10-13

2014-01-17