甜杏仁和苦杏仁野黑櫻苷水解酶基因的克隆

白羽嘉，王 敏，陶永霞，徐 樂，馮作山,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺果樹資源圃，新疆 輪臺 841600）

甜杏仁和苦杏仁野黑櫻苷水解酶基因的克隆

白羽嘉1,2，王 敏2，陶永霞2，徐 樂3，馮作山1,2,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺果樹資源圃，新疆 輪臺 841600）

以輪臺小白杏（甜杏仁品種）和甲麥黃杏（苦杏仁品種）為實驗材料，采用同源基因克隆方法克隆野黑櫻苷水解酶（prunasin hydrolase，PH）基因。輪臺小白杏PH基因命名為PaLTPh（GenBank登錄號：KF888615），序列長度3 686 bp；甲麥黃杏PH基因命名為PaMJPh（KF888616），序列長度3 690 bp。PaLTPh和PaMJPh與扁桃Ph691基因相似性為94%。根據(jù)PaLTPh和PaMJPh保守區(qū)序列設(shè)計引物，克隆編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列。PaLTPh CDS（KF888617）和PaMJPh CDS（KF888618）序列長度均為1 635 bp，與扁桃Ph691全CDS區(qū)相似性為97%。PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均為全長的開放閱讀框，編碼蛋白質(zhì)長度為544 個氨基酸。PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含長度為26 個氨基酸的信號肽和糖基水解酶家族Ⅰ結(jié)構(gòu)域，可催化野黑櫻苷水解為扁桃腈和葡萄糖。杏PH基因與扁桃Ph691具有高度的同源性。

輪臺小白杏；甲麥黃杏；野黑櫻苷；野黑櫻苷水解酶；基因克隆

杏仁營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)[1]，通常被加工成杏仁油、杏仁露、鹽焗杏仁等食品[2-3]。杏仁根據(jù)苦杏仁苷含量的多少分為甜杏仁和苦杏仁，甜杏仁中苦杏仁苷＜0.1%，而苦杏仁中苦杏仁苷含有在2%～4%[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷具有一定的藥理保健活性，具有鎮(zhèn)咳、平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛、驅(qū)蟲殺菌等功效[6]。但過量攝入苦杏仁或苦杏仁苷，則會引起食物中毒，因此苦杏仁的安全性問題受到廣泛的關(guān)注[7-9]。

苦杏仁苷存在于薔薇科植物杏、山杏、桃、山桃及李的種子中[10]?？嘈尤受眨╝mygdalin）是一種生氰二糖苷，結(jié)構(gòu)式為苯羥基乙氰-β-D-葡萄糖-6-β-D-葡萄糖苷。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)（圖1），苦杏仁腈（mandelonitrile）在二磷酸尿苷葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶GT1（UDP-glucuronide transferases，GT）作用下合成野黑櫻苷，野黑櫻苷在GT2的催化下合成苦杏仁苷[11]；野黑櫻苷作為苦杏仁苷的合成前體，能夠被野黑櫻苷水解酶（prunasin hydrolases，PH）水解生成扁桃腈和葡萄糖[12-13]。植物在生長發(fā)育過程中野黑櫻苷水解酶（EC 3.2.1.21）參與了苦杏仁苷及野黑櫻苷的降解代謝，野黑櫻苷水解酶調(diào)控野黑櫻苷的濃度，進(jìn)而影響苦杏仁苷的生物合成[14-15]。相關(guān)研究鑒定出2 個在甜扁桃和苦扁桃中差異的PH基因（Ph691和Ph692），對果實發(fā)育過程中外皮、珠心、胚乳和胚中PHs進(jìn)行組織和細(xì)胞化學(xué)定位，發(fā)現(xiàn)PH蛋白在種仁不同發(fā)育時期的質(zhì)外體和共質(zhì)體之間產(chǎn)生移動[16]。

圖1 苦杏仁腈、野黑櫻苷和苦杏仁苷的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of mandelonitrile, prunasin andamygdalin

新疆杏果樹資源豐富，南疆環(huán)塔里木盆地周圍有大面積的栽培，是新疆最具特色的果樹品種之一[17]。杏果實除鮮食外，杏仁還是重要的木本糧油資源，杏仁粕含有大量的蛋白質(zhì)可以被開發(fā)利用[18]。新疆杏品種豐富多樣，但存在大量的苦杏仁品種，不利于食品加工和資源的綜合利用。目前苦杏仁苷的研究主要集中在提取純化[19]、分析檢測[20-21]、安全控制及生物活性等方面[22-23]，對苦杏仁苷形成相關(guān)基因的報道并不多見。本研究以輪臺小白杏（甜杏仁品種）和甲麥黃杏（苦杏仁品種）為實驗材料，克隆野黑櫻苷水解酶基因，對編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，有助于了解杏仁中苦杏仁苷的合成與降解途徑，為食品原料的生物檢測、遺傳育種和栽培種植提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輪臺小白杏果實（Prunus armeniaca L. cultivar LunTai Xiaobaixing，簡稱LT）、甲麥黃杏果實（Prunus armeniaca L. cultivar Jiamaihuangxing，簡稱MJ），于2013年6月1日采集自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺果樹資源圃（國家果樹種質(zhì)資源輪臺果樹資源圃）。

植物DNA提取試劑盒（SK1203）、柱式植物總RNA抽提純化試劑盒、M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（BS249）、AMV First Strand cDNA Synthesis Kit第一鏈cDNA合成試劑盒、LA TaqDNA聚合酶、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（SK1131）、T-載體pcr產(chǎn)物克隆試劑盒（SK2211）、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、一步法制備感受態(tài)細(xì)胞溶液（SK2301）、DNA Marker、6×DNA Loading Dye、溴化乙錠 生工生物工程（上海）股份有限公司；ABI SybrGreen PCR Master Mix（2×） 美國ABI公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司、三羥甲基氨基甲烷、冰乙酸、鹽酸、EDTA-Na2均為分析純 國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS高溫滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械公司；JH-SCA凈化工作臺 上海鴻都電子科技有限公司；Biofuge Primo R高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技公司；T-100梯度PCR儀、PowerPac Universal電泳儀、Sub Cell GT水平電泳槽 美國伯樂公司；Gene Genius Bio Image凝膠成像系統(tǒng) 英國SynGene公司；U-3010紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 野黑櫻苷水解酶基因擴增引物設(shè)計

參考甜仁扁桃野黑櫻苷水解酶基因序列（JQ268617.1、JQ268619.1、JQ268621.1、JQ268623.1）和苦仁扁桃野黑櫻苷水解酶基因序列（JQ268618.1、JQ268620.1、JQ268622.1、JQ268624.1），設(shè)計野黑櫻苷水解酶基因擴增引物（表1）。引物設(shè)計擴增片段之間存在大于200 bp堿基的重疊，以保證DNA拼接的準(zhǔn)確性。

表1 野黑櫻苷水解酶基因PCR擴增引物Table1 Primer sequences for PCR amplification of PH gene

1.3.2 野黑櫻苷水解酶基因的克隆

取新鮮杏種仁液氮研磨，按植物D N A提取試劑盒說明書提取基因組DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系總體積25 μL，包括：基因組DNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP （10 mmol/L） 0.2 μL，2×GC BufferⅠ 12.5 μL，ddH2O 10.1 μL，LA TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；94℃ 30 s，Tm30 s，72 ℃ 90 s，33 個循環(huán)；72 ℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物電泳后采用試劑盒回收純化DNA。連接到pMD18-T載體，連接反應(yīng)體系10.0 μL（包括SolutionⅠ 4 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，pMD18-T 0.2 μL，H2O 0.8 μL），16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，倒置培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3 杏野黑櫻苷水解酶cDNA序列的克隆

取新鮮杏種仁液氮研磨，按柱式植物總RNA抽提純化試劑盒方法提取總RNA。cDNA第一鏈合成按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴增體系及克隆測序同1.3.1節(jié)。

1.3.4 生物信息分析

序列拼接：克隆測序采用雙向測序獲得DNA片段序列，采用DNAMAN軟件對序列進(jìn)行拼接。

核酸生物信息分析：引物設(shè)計使用軟件Primer Premier 5.0，序列拼接及比對分析使用DNAMAN v7.0軟件，序列檢索通過在線NCBI進(jìn)行，進(jìn)化樹構(gòu)建使用MEAG 5.05軟件。

蛋白生物信息分析：ORF分析使用ORF Finder在線分析，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SMART（simple modular architecture research tool）在線分析[24]，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域使用Pfam 27.0（March 2013，14831 families）進(jìn)行在線分析[25]，信號肽的預(yù)測分析使用SignalP 4.1 Server在線進(jìn)行。

圖2 2 PaLTPhaLTPh和PaMJPhaMJPh PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR results for PaLTPh and PaMJPh

表2 PaLTPh和PaMJPh在NCBI中的檢索結(jié)果Table2 Retrieval results for PaLTPh and PaMJPh in NCBI database

2 結(jié)果與分析

2.1 野黑櫻苷水解酶基因的克隆

輪臺小白杏基因組4 對引物（LT1～LT4）分別擴增出1 200、1 500、350、1 500 bp的DNA片段，克隆測序后拼接獲得長度為3 686 bp的DNA序列；甲麥黃杏基因組3 對引物均擴增出1 500 bp大小的DNA片段，克隆測序后拼接獲得長度為3 690 bp的DNA序列（圖2）。

BLASTn鑒定核酸序列為野黑櫻苷水解酶基因（表2）。輪臺小白杏野黑櫻苷水解酶基因PaLTPh（Pruns armeniana LT prunasin hydrolase，PaLTPh）與扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性為94%，與扁桃Ph692基因（JQ268619.1、JQ268620.1）相似性為83%；甲麥黃杏野黑櫻苷水解酶基因PaMJPh（Pruns armeniana MJ prunasin hydrolase，PaMJPh）與扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性為94%，與扁桃Ph692基因（JQ268619.1、JQ268620.1）相似性為分別為87%和83%。

2.2 輪臺小白杏與甲麥黃杏野黑櫻苷水解酶CDS序列的克隆

圖3 野黑櫻苷水解酶cDNA PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results for PH cDNA

根據(jù)野黑櫻苷水解酶基因序列的保守型設(shè)計引物PaPH CDS，以杏種仁cDNA為模板，克隆全CDS區(qū)序列。輪臺小白杏和甲麥黃杏cDNA均擴增出1 600 bp左右的DNA片段，克隆測序后獲得輪臺小白杏PaLTPh CDS序列和甲麥黃杏PaMJPh CDS序列（圖3）。PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列長度均為1 635 bp，BLASTn檢索鑒定與扁桃Ph691完整CDS序列（JQ268622.1、JQ268621.1）相似性為97%。

根據(jù)PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列BLASTn搜索同源性較高的核酸序列，包括：扁桃（Prunus dulcis）、美國黑櫻（Prunus serotina）、甜櫻桃（Prunus avium）、蘋果（Malus×domestica）、草莓（Fragaria）等物種的Phs。采用鄰接（Neghbor-Joining）方法構(gòu)建上述物種的核苷酸序系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），不同物種的野黑櫻苷水解酶基因可分為4 類，扁桃Ph691和杏聚為一類，美國黑櫻和甜櫻桃聚為一類，蘋果和草莓單獨各聚為一類。但扁桃Ph692較為特殊，進(jìn)化分析中扁桃Ph692并沒有與扁桃Ph691和杏聚為一類，而是進(jìn)化為美國黑櫻中的一個獨立分支。

圖4 野黑櫻苷水解酶CDS區(qū)核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on CDS nucleotide sequences of PH genes from different species

PaLTPh CDS和PaMJPh CDS存在堿基差異（圖5），主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換（A-G/C-G）和顛換（A-C/G-T），未出現(xiàn)堿基缺失和插入。參考扁桃Ph691和Ph692序列進(jìn)一步比對，發(fā)現(xiàn)杏Ph基因CDS與扁桃Ph691 CDS（JQ268621.1、JQ268622.1）核苷酸的差異表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換和顛換，與扁桃Ph692 CDS（JQ268623.1、JQ268624.1）核苷酸的差異則出現(xiàn)了堿基的插入（序列位置：1 084～1 086、1 103～1 108、1 638～1 643）和缺失（序列位置：80～82、1 302～1 307）。堿基的插入和缺失會導(dǎo)致該基因所翻譯的蛋白質(zhì)產(chǎn)生較大的差異。

圖5 杏野黑櫻苷水解酶CDS與扁桃黑櫻苷水解酶CDS序列比對Fig.5 Sequence alignment of different Phs from PaLTPh CDS and PaMJPh CDS with Prunns dulics Phs

2.3 杏野黑櫻苷水解酶預(yù)測蛋白及分析

圖6 PaLTPh CDS的ORF分析Fig.6 Analysis of open reading frame (ORF) of PaLTPh CDS

使用NCBI中ORF Finder 軟件對序列分析（圖6、7），PaLTPh CDS序列和PaMJPh CDS序列包含起始密碼子和終止密碼子，為全長的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼蛋白質(zhì)長度為544 個氨基酸，兩者相似性為97.06%。

圖7 PaMJPh CDS的ORF分析Fig.7 Analysis of open reading frame (ORF) of PaMJPh CDS

圖8 野黑櫻苷水解酶蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.8 Analysis of prunasin hydrolase protein structure

使用Pfam 27.0對編碼蛋白序列進(jìn)行分析（圖8），PaLTPH和PaMJPH均包含一個長度為26 個氨基酸（氨基酸殘基1～26）的信號肽及糖基水解酶家族Ⅰ（Pfam:Glyco_hydro_1）結(jié)構(gòu)域。

在線SignalP 4.1 Server對蛋白序列信號肽進(jìn)行預(yù)測分析（圖9、10），PaLTPH和PaMJPH在1～26aa序列S值較高，預(yù)測該氨基酸序列為信號肽。PaLTPH信號肽序列為MALQFRSLLLCVVLLLLGFSLANTNA，PaMJPH信號肽序列為MALQFRSLLLCVVLFLLGFALANTNA，比較發(fā)現(xiàn)第13個氨基酸殘基（由Ile變成Phe）和第19個氨基酸殘基（由Ser變成Ala）存在差異。參考比對扁桃PH691蛋白（AFH35014.1、AFH35015.1）信號肽發(fā)現(xiàn)，4 個蛋白的信號肽在11、13和19氨基酸殘基存在差異。對比CDS序列分析，發(fā)現(xiàn)這種差異是由于核苷酸堿基33、42、44、57、59發(fā)生改變引起的。

信號肽在蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運過程中有重要的作用。編碼分泌蛋白的mRNA在翻譯時首先合成的是N末端帶有疏水氨基酸殘基的信號肽，它被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體識別并與之相結(jié)合；信號肽經(jīng)由膜中蛋白質(zhì)形成的孔道到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔，隨即被位于腔表面的信號肽酶水解，由于它的 引導(dǎo)，新生的多肽就能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入腔內(nèi)，最終被分泌到胞外；翻譯結(jié)束后，核糖體亞基解聚、孔道消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜又恢復(fù)原先的脂雙層結(jié)構(gòu)[26-28]。杏種仁和扁桃種仁中野黑櫻苷水解酶含有信號肽，相似性為96.15%，野黑櫻苷水解酶最終分泌到胞外，參與野黑櫻苷的代謝。野黑櫻苷水解酶屬O-糖基水解酶，O-糖基水解酶是一個廣泛的水解酶家族，能水解2 個（或2 個以上）糖形成的糖苷鍵，或水解糖與非糖基團(tuán)所形成的化學(xué)鍵，生成單糖及非糖組分[29]。對PaLTPH和PaMJPH的Glyco_hydro_1結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（表3），PaLTPH、PaMJPH 與AFH35014.1、AFH35015.1同屬于Glycosyl hydrolase family 1蛋白家族，HMM的長度為455 個氨基酸，預(yù)測活性位點為210和426。杏與扁桃野黑櫻苷水解酶蛋白具有高度相似的結(jié)構(gòu)域及活性位點，推測杏種仁與扁桃種仁中野黑櫻苷水解在苦杏仁苷的合成與代謝調(diào)控中起到相似的作用。

圖9 PaLTPH信號肽預(yù)測分析Fig.9 Predictive analysis of PaLTPH signal peptide

圖 10 PaMJPH信號肽預(yù)測分析Fig.10 Predictive analysis of PaMJPH signal peptide

表3 野黑櫻苷水解酶Glyco_hydro_1結(jié)構(gòu)域分析Table3 Analysis of prunasin hydrolase Glyco_hydro_1 domain

3 結(jié)論與討論

采用同源基因克隆的方法從輪臺小白杏中克隆獲得PaLTPh，序列長度3 686 bp；從甲麥黃杏中克隆獲得PaMJPh，序列長度3 690 bp。PaLTPh和PaMJPh與扁桃Ph691基因相似性為94%，具有高度的同源性。

利用PaLTPh和PaMJPh序列的設(shè)計引物，以杏種仁cDNA為模板，克隆CDS區(qū)序列。PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列長度均為1 635 bp，與扁桃Ph691全CDS區(qū)（JQ268622.1、JQ268621.1）相似性為97%。

PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均包含起始密碼子和終止密碼子，為全長的開放閱讀框ORF，編碼蛋白質(zhì)長度為544 個氨基酸。PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含長度為26 個氨基酸的信號肽和糖基水解酶家族Ⅰ（Pfam:Glyco_hydro_1）結(jié)構(gòu)域，可催化野黑櫻苷水解為扁桃腈和葡萄糖。

扁桃和杏同屬薔薇科核果類果樹，其苦仁中所含的苦味物質(zhì)都是苦杏仁苷。研究利用扁桃野黑櫻苷水解酶基因，進(jìn)行同源克隆，獲得杏仁中野黑櫻苷水解酶基因（PaLTPh、PaMJPh），其基因序列與扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性更高，蛋白預(yù)測分析顯示其相似性為98.67%，同屬于Glyco_hydro_1家族。野黑櫻苷水解酶作為苦杏仁苷合成關(guān)鍵基因，已從美洲黑櫻（Prunus serotina）[30-32]，甜櫻桃（Prunus avium）[33-34]及扁桃（Prunus dulcis）中克隆到相關(guān)的基因，隨著桃（Prunus persica）基因組測序與組裝的完成，也預(yù)測出野黑櫻苷水解酶相關(guān)基因[35-37]。從杏種仁中克隆野黑櫻苷水解酶基因，豐富了其基因的多樣性，對杏仁種在發(fā)育過程中Ph基因的表達(dá)情況、細(xì)胞化學(xué)定位還有待深入研究。

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Cloning of Prunasin Hydrolase Gene from Sweet and Bitter Apricot Kernels

BAI Yu-jia1,2, WANG Min2, TAO Yong-xia2, XU Le3, FENG Zuo-shan1,2,*
(1. College of Forestry and Horticulture, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China; 2. College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China; 3. Luntai Plant Germplasm Resources Garden, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Luntai 841600, China)

Prunasin hydrolase (PH) gene was cloned from sweet and bitter apricot (Prunus armeniaca L.) kernels from the cultivars Luntai Xiaobaixing and Jiamaihuangxing, respectively. The PH gene from Luntai Xiaobaixing was named as PaLTPh (GenBank accession number: KF888615) with a sequence length of 3 686 bp, and that from Jiamaihuangxing was named as PaMJPh (GenBank accession number: KF888616) with a sequence length of 3 690 bp. Analysis of the nucleotide sequences indicated that the homology between the PH gene and the PH691 gene of Prunus dulcis reached up to 94%. Moreover, the coding sequence (CDS) region was cloned according to the conserved regions of PaLTPh and PaMJPh. The sequence length of both PaLTPh CDS (KF888617) and PaMJPh CDS (KF888618) was 1 635 bp. Both these CDS regions were full open reading frame (ORF) sequences, encoding a protein consisting of 544 amino acid (aa) residues. Both proteins contained an amino-terminal signal peptide with 26 AA residues and the domain of glycosyl hydrolase family Ⅰ for PaLTPH and PaMJPH, which can catalyze the hydrolysis of prunasin to mandelonitrile and glycosides. This study has demonstrated that the PH gene from apricot has high homology with the Ph691 of Prunus dulcis.

Prunus armeniaca L. cultivar Luntai Xiaobaixing; Prunus armeniaca L. cultivar Jiamaihuangxing; prunasin; prunasin hydrolase; gene cloning

S622.2

A

1002-6630（2014）23-0226-06

10.7506/spkx1002-6630-201423044

2013-11-30

白羽嘉（1984—），男，博士研究生，研究方向為果蔬采后生理及貯運。E-mail：saintbyj@126.com

*通信作者：馮作山（1963—），男，教授，博士，研究方向為果蔬采后生理及貯運。E-mail：fengzuoshan@126.com