李光喜 關(guān)琴笑 林捷欣 趙 路 王淑美

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州510006)

通脈復(fù)方有效部位中葛根素的含量測定※

李光喜 關(guān)琴笑 林捷欣 趙 路 王淑美*

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州510006)

目的 建立高效液相色譜法對通脈復(fù)方中葛根素含量測定的方法。方法 采用Diamonsil C18(250×4.6mm 5μm)色譜柱；流動相：甲醇-水(25∶75)；流速：1.0ml／min；檢測波長：250nm；柱溫：25℃。結(jié)果 葛根素在2.18～6.564μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.9995)；平均回收率為99.54%，RSD為2.04%(n=6)。結(jié)論 該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于通脈復(fù)方的質(zhì)量控制。

葛根素；高效液相色譜；通脈；含量測定

通脈全方由丹參、川芎、葛根組成，具有活血通脈的功效，用于缺血性心腦血管疾病、動脈硬化、腦血栓、腦缺血、冠心病、心絞痛等疾病。方中葛根具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉的作用。可用于治療急性腦梗死和腦供血不足，其主要成分為葛根素［1-2］。本文采用高效液相色譜法對通脈有效部位中的葛根素進(jìn)行了含量測定，從而控制通脈復(fù)方的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀含二元梯度泵、CTO-20A柱溫箱(日本島津)，SPD-20A紫外-可見檢測器，LCSOLUTION(VER.1.21)工作站；METTLER AE240電子分析天平(瑞士)；BSZZ4S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；6202小型高速粉碎機(jī)(北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司)；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 葛根素對照品(批號110752-200410)，購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇(天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，色譜純)。其他試劑為分析純。

1.3 藥材來源 丹參、川芎、葛根藥材均購自于廣州致信藥材有限公司，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定丹參為唇形科植物丹參Salvi amiltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖；川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖；葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［3］色譜柱：Diamonsil C18(250× 4.6mm 5μm)色譜柱；流動相：甲醇-水(25∶75)；流速：1.0ml／min；檢測波長：250nm；柱溫：25℃。

2.2 葛根素對照品溶液的制備 精密稱取葛根素對照品10.67mg，置25ml量瓶中，加入30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2ml，置10ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，即得葛根素濃度為0.0854mg·ml-1的對照品溶液。

2.3 有效部位的制備 丹參醇提后藥渣、川芎提揮發(fā)油后藥渣、葛根藥材按處方比例混勻，8倍藥材量50%乙醇浸泡30分鐘，回流提取2次，每次1小時。過濾，合并兩次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑至無醇味，加蒸餾水分散為濃度110mg·ml-1(生藥量)上樣，樹脂柱的徑高比為1∶10，上樣量與樹脂體積比為1∶2.8，靜置吸附3小時，以2倍樹脂體積的蒸餾水清洗后，用50%的乙醇洗脫，洗脫劑用量為6倍量樹脂體積。加壓回收洗脫劑，低溫干燥，即得。

2.4 供試品溶液的制備 稱取有效部位樣品0.05g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 陰性樣品溶液的制備 稱取丹參、川芎藥材適量按有效部位制備工藝制得缺葛根藥材的陰性樣品混合均勻，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液、對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。記錄其HPLC液相色譜圖，結(jié)果表明通脈有效部位中葛根素色譜峰分離良好且陰性樣品溶液無干擾。結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 葛根素對照品色譜圖

圖2 有效部位供試品色譜圖

圖3 陰性樣品溶液的色譜圖

2.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取對照品溶液依次配制成濃度為0.109μg／μl、0.1663μg／μl、0.82188μg／μl、0.2735μg／μl、0.3282μg／μl的溶液，分別精密吸取20μl，注入液相色譜儀，測定峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=3E+06x+1E+06(r= 0.9995)。結(jié)果表明葛根素在2.18μg～6.564μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度考察 精密吸取同一對照品溶液20μl注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定5次，測得峰面積。結(jié)果顯示，RSD=1.49%，該方法的精密度良好。

2.8 重復(fù)性考察 取同一批有效部位樣品5份，每份約50mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按2.4項(xiàng)下供試品溶液的處理方法處理，精密吸取供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，記錄峰面積，并計算葛根素的含量，結(jié)果表明，RSD=1.03%，該方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液20μl，分別在制備后0h、1h、3h、6h、8h、12h注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，記錄峰面積。結(jié)果顯示，RSD=1.41%，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品約0.011g，共6份，精密稱定，分別精密加入濃度為0.4268mg· ml-1的葛根素對照品溶液3ml置錐形瓶中，按照2.4項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)測定結(jié)果(%)

結(jié)果表明，葛根素的平均加樣回收率為99.54%，RSD為2.04%，符合定量分析的要求。

2.11 樣品的含量測定 取3批號的有效部位樣品各5份，每份約0.05g，精密稱定，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計算供試品的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品葛根素的含量測定結(jié)果(%)

3 討論

三批樣品中葛根數(shù)的含量測定結(jié)果及方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立的高效液相色譜法操作簡便、精密度和重現(xiàn)性良好、回收率合格、測定結(jié)果準(zhǔn)確，可作為通脈有效部位中葛根素的質(zhì)量控制方法。

［1］彭家先，曹觀新.葛根素治療急性缺血性腦梗塞28例［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，25(3)：66-67.

［2］王利亞，陶宏韜.葛根素治療急性腦梗塞60例［J］.哈爾濱醫(yī)藥，2003，23(6)：8-9.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：312-313.

Determination on content of puerarin in the effective fraction of Tongmai Decoction

Li guangxig uan Qinxiao Lin Jiexin Zhao Lu Wang Shumei?
（Chinese medicinal herb college guangdong pharmaceutical university，guangzhou，510006，China）

Objective To establish the HPLC method for the content determination of puerarin in Tongmai Decoction.Methods The HPLC was applied with Diamonsil C18(250×4.6mm 5μm)column by methanol-water(25∶75)as the mobile phase the flow rate was 1.0ml／min.The column temperature was 25℃and the detection wavelength was 250nm.Results The linear range of Puerarin was 2.18～6.564μg(r=0.9995) with an average recovery of 99.54%(RSD=2.04%n=6).Conclusion The method is sample accurate sensitive and reproducible it can use to control the quality of Tongmai.

Puerarin；HPLC；Tongmai Decoction；Content determination

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.03.097

1672-2779(2014)-03-0149-02

蘇 玲 本文校對：梁生旺

2013-10-20)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目［No：81073024］；廣東省中醫(yī)藥局基金項(xiàng)目［No：20112152］

*通訊作者