張華 綜述 馮永 審校

Waardenburg綜合征(Waardenburg Syndrome，WS)是最常見的綜合征型聾，又稱聽力-色素綜合征，主要遺傳方式為單基因致病的染色體顯性遺傳伴不全外顯。其病因主要是由于神經(jīng)嵴(neural crest，NC)發(fā)育異常而導(dǎo)致其分化的黑素細(xì)胞發(fā)育障礙所致[1]，PAX3(Pair Box 3，配對盒基因3)是NC生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控基因之一。WS人群發(fā)病率為1/42 000，占先天性聾的2%～5%，聾啞人群中其發(fā)病率為0.9%～2.8%[2]。該綜合征主要臨床特征為感音神經(jīng)性聾及虹膜、頭發(fā)和皮膚的色素分布異常。WS具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性，依據(jù)不同的伴隨表型將其分為4型(WS1-4)[3]，其中以WS1和WS2最多見。已證實有6種基因與WS有關(guān)[3]，PAX3是其主要的致病基因之一，其突變可導(dǎo)致WS1和WS3。本文就PAX3基因在WS發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展予以綜述。

1PAX3基因簡述

1.1PAX3基因結(jié)構(gòu)與分布表達(dá) PAX3基因定位于2q35-2q37，包含10個外顯子，cDNA全長1.4 kb，其編碼的PAX3蛋白是配對盒轉(zhuǎn)錄因子PAX家族成員之一。人和小鼠PAX蛋白家族共有九個成員，PAX3蛋白在脊椎動物高度保守，人和小鼠的PAX3蛋白氨基酸序列高度保守，同源性達(dá)98%[3]。PAX3在人和小鼠神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌和骨骼肌系統(tǒng)的正常形成和發(fā)育中起關(guān)鍵作用[4，5]。PAX3在小鼠胚胎期第8.5天(E8.5)時開始表達(dá)，在第9～12天(E9～E12)達(dá)高峰，第13天(E13)時開始下降，到第17天(E17)表達(dá)最低。PAX3最早于NC遷徙前在背神經(jīng)管表達(dá)，后隨神經(jīng)管的遷徙發(fā)育而逐漸開始在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、關(guān)節(jié)、骨骼肌以及NC源性組織如周圍神經(jīng)系統(tǒng)(感覺和運動神經(jīng)節(jié)、脊神經(jīng)后根、交感神經(jīng)節(jié)、胃腸道神經(jīng)節(jié))、心肌間質(zhì)、平滑肌、胸腺、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、皮膚毛發(fā)和內(nèi)耳的黑素細(xì)胞中廣泛表達(dá)，調(diào)控胚胎的生長發(fā)育，在骨骼肌、腫瘤及黑色素的形成過程中發(fā)揮重要作用。

1.2PAX3基因蛋白結(jié)構(gòu)與功能域 PAX3蛋白由479個氨基酸組成，分子量約53 kD，主要特征是含有4個高度保守的結(jié)構(gòu)域[4]：配對盒結(jié)構(gòu)域(paired box domain，PD)、同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain，HD)、高度保守的鋅肽序列和富含絲氨酸-蘇氨酸-脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活域，其中PD和HD是PAX3蛋白的重要功能域，具有高度的保守性，主要作用是與特異DNA結(jié)合。GTTCC或GTTAC及ATTA分別是PD和HD結(jié)合DNA的核心序列[6]。

PD在PAX3的氨基末端區(qū)，由第34～161位共128個氨基酸組成，包括2～4號外顯子，含有2個亞結(jié)構(gòu)域PAI和RED，分別位于PD的N端和C端。每個PAI域和RED域各有一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)結(jié)構(gòu)，每個HTH序列均由3個α-螺旋組成[4]。PAI的作用是結(jié)合DNA以及促進(jìn)PAX3與其他蛋白的相互作用，RED亞區(qū)在PAX3蛋白中的作用還不是很清楚。體外實驗[7，8]顯示PD促進(jìn)PAX3與DNA結(jié)合以及與其他蛋白相互作用，如與含有高遷移組功能域(high mobility group，HMG)的SOX10蛋白[SRY (sex determining region Y)-box 10，性別區(qū)決定盒10]和CIB1蛋白(calcium and integrin binding 1, 鈣粘和蛋白1)相互作用。通過PD域，PAX3與SOX10可協(xié)同激活在黑素細(xì)胞中起重要調(diào)控作用的MITF基因(microphthalmia-associtated transcription factor，小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)和c-RET基因(cret receptor tyrosine kinase，酪氨酸蛋白激酶受體)轉(zhuǎn)錄。HD是PAX3蛋白與DNA結(jié)合以及與其他蛋白相互作用的另一個功能域，由第220～277位共58個氨基酸組成，包括5、6號外顯子，包含3個α-螺旋結(jié)構(gòu)：螺旋Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。同PD一樣，HD可與其它蛋白作用以調(diào)控PAX3活性[4]，也可調(diào)節(jié)PD與DNA的結(jié)合[9]。二者在功能上并非相互獨立，而是可以相互作用促進(jìn)PAX3蛋白與DNA結(jié)合。PD的突變可以影響HD與DNA的結(jié)合，HD的突變也可以影響PD與DNA的結(jié)合[10]。

2 PAX3基因突變與WS1/WS3

1992年Tassabegji和Baldwin首次在WS1患者檢測到PAX3基因雜合突變，使得PAX3成為WS的第一個致病基因，揭開了從分子水平研究WS發(fā)病機(jī)制的序幕。1993年Hoth在WS3患者中檢測到PAX3基因雜合突變[11]，同年P(guān)AX3突變小鼠模型Sploth(Spl)小鼠建立[12]，純合突變Pax3小鼠Spl(-/-)由于神經(jīng)管發(fā)育缺陷如脊柱裂、腦膨出和先天性心臟缺陷而在胚胎期、妊娠中期或出生后不久就死亡。雜合突變Pax3小鼠Spl(+/-)主要特征是腹部、尾部和足部出現(xiàn)斑片狀色素缺失。人的PAX3雜合突變導(dǎo)致輕度的WS1表型，而純合或復(fù)合雜合PAX3突變則導(dǎo)致嚴(yán)重的WS3表型，如腦膨出、脊柱裂和上肢發(fā)育畸形，部分病例導(dǎo)致患兒在胚胎期或嬰兒期死亡[13]。PAX3基因突變包括錯義突變、無義突變、移碼突變、小的堿基插入和缺失、剪切位點改變。目前已經(jīng)報道的致WS的PAX3基因突變共有98種(http：//hearing.harvard.edu/genepages/pax3dream.html)，其中致WS1基因突變80種，致WS3基因突變18種，一半是錯義突變，一半是無義或移碼突變，也有部分或全基因缺失突變報道[2]。約95%的突變位點位于2～5號外顯子，其中2號外顯子的突變發(fā)生率最高，其次為5、6號外顯子[3]。90%的WS1患者和50%的WS3患者中能檢測到PAX3突變[3]。

3 PAX3基因在WS發(fā)病中的作用

NC由神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cell，NCC)組成，是起源于背神經(jīng)管的多潛能細(xì)胞群。脊椎動物NCC在胚胎發(fā)育早期即出現(xiàn)在背神經(jīng)管中，在沿背神經(jīng)管遷徙的過程中逐漸分化為黑素細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、骨和軟骨細(xì)胞以及內(nèi)分泌細(xì)胞，參與許多組織的發(fā)育并逐漸分化為NC源性衍生物，包括肌肉骨骼系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌腺、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和黑素細(xì)胞[14，15]。由于NCC發(fā)育不全導(dǎo)致的這些組織和細(xì)胞的病變統(tǒng)稱為神經(jīng)嵴病，約有20余種，WS即為其中之一。從NC分化為黑素細(xì)胞是一較為復(fù)雜的過程，NCC通過增殖、遷徙、生存、分化等過程逐漸演變?yōu)楹谒厍绑w細(xì)胞后到達(dá)真皮、表皮、內(nèi)耳血管紋和眼睛的脈絡(luò)膜，并開始發(fā)育為黑素細(xì)胞[16～18]。黑素細(xì)胞最重要的功能是產(chǎn)生黑色素以確保毛發(fā)和皮膚的色素沉著[19～21]。PAX3參與上述生理過程并在NC的發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。PAX3基因突變必然會造成NC、NC源性組織和細(xì)胞的發(fā)育異常，進(jìn)而導(dǎo)致黑素細(xì)胞發(fā)育不良，黑色素合成減少，表現(xiàn)為皮膚、毛發(fā)、虹膜低色素。血管紋是內(nèi)耳耳蝸結(jié)構(gòu)之一，在內(nèi)淋巴生成過程中起重要作用，動物模型研究[22]顯示黑素細(xì)胞發(fā)育不良會引起血管紋中黑素細(xì)胞源性的中間細(xì)胞缺乏進(jìn)而造成柯蒂器退化變性，最終導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾。同時由于顱面骨、四肢骨骼肌肉均來源于胚胎的NC，因此NC的發(fā)育異常必然會導(dǎo)致這些組織和器官的發(fā)育異常，從而產(chǎn)生了WS的一系列伴隨癥狀。

3.1PAX3基因?qū)C發(fā)育的調(diào)控 PAX3基因在胚胎NC的發(fā)育中起關(guān)鍵作用，NC的發(fā)育依賴PAX3的正常功能。人和小鼠的PAX3基因表達(dá)水平下調(diào)時就會影響NC的正常發(fā)育。PAX3主要通過調(diào)控c-RET、Wnt1和轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)的表達(dá)促進(jìn)NC遷徙、生存和增殖[4，7，23，24]，c-RET、Wnt1和TGF-β2是NC發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子。c-RET跨越NCC源性細(xì)胞胞膜，參與NCC的遷徙與增殖[5，25]。Wnt1參與神經(jīng)嵴分化[26]，缺乏PAX3表達(dá)的小鼠胚胎背神經(jīng)管中的Wnt1表達(dá)減少。TFG-β2參與NCC分化與凋亡[27]，TGF-β2純和突變小鼠可出現(xiàn)神經(jīng)嵴病，影響心臟、顱面骨結(jié)構(gòu)、泌尿生殖系統(tǒng)和內(nèi)耳發(fā)育，PAX3敲除小鼠胚胎的TGF-β2表達(dá)明顯減少。

3.2PAX3對黑素細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控 PAX3在黑素細(xì)胞增殖、抗凋亡、遷徙、細(xì)胞系特異分化中起重要作用[4]。MITF、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrosinase related protein 1，TRP1)和多巴色素異構(gòu)酶(dopachrome tautomerase，DCT)是黑素細(xì)胞發(fā)育和黑色素合成中關(guān)鍵性和標(biāo)志性調(diào)控因子。在黑素細(xì)胞的發(fā)育中，PAX3主要通過直接或與其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用激活或抑制MITF、DCT和TRP1的表達(dá)，參與調(diào)控黑素細(xì)胞的生長、發(fā)育與分化[4，28]，既能促進(jìn)也能抑制黑色素合成。MITF和TYRP1是PAX3直接調(diào)控的下游靶基因，PAX3可直接上調(diào)TYRP1表達(dá)[29]，使黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素。PAX3單獨上調(diào)MITF表達(dá)的能力較弱，需與SOX10相互作用協(xié)同激活并上調(diào)MITF轉(zhuǎn)錄，二者在MITF啟動子上的DNA結(jié)合位點僅相差一個堿基[8，30]。PAX3通過PD域和HD域與MITF轉(zhuǎn)錄起始點上游的順式作用元件結(jié)合后調(diào)控MITF的表達(dá)來影響成黑素細(xì)胞向黑素細(xì)胞發(fā)展[29]。PAX3基因通過和淋巴增強(qiáng)因子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF1)及Groucho相關(guān)蛋白4(Groucho-related protein 4，Grg4)在DCT增強(qiáng)子上形成復(fù)合體阻止MITF與DCT的結(jié)合而抑制DCT表達(dá)[4]，PAX3基因通過抑制DCT表達(dá)、阻止MITF與DCT啟動子結(jié)合來防止終末分化因子的表達(dá)。但當(dāng)β-catenin存在時，LEF1與MITF形成蛋白復(fù)合體并使PAX3基因離開DCT增強(qiáng)子，MITF進(jìn)而上調(diào)DCT表達(dá)。盡管黑素細(xì)胞發(fā)育調(diào)控機(jī)制的整個分子途徑還不清楚，但PAX3對MITF、DCT和TYRP1三個基因的調(diào)控代表了整個機(jī)制的一部分，其作用在于使黑素干細(xì)胞向黑素細(xì)胞分化的同時阻止其終末分化并保證黑素細(xì)胞的增殖，維持其生長。

PAX3基因還可通過與其他蛋白相互作用來完成對下游基因轉(zhuǎn)錄的抑制或激活而影響它們的表達(dá)[7，31]，進(jìn)而影響黑素細(xì)胞的發(fā)育。SOX10和TAZ蛋白(tafazzin，亦稱WW domain-containing transcriptional regulator 1，WWTR1，雙W域轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1)可以增強(qiáng)PAX3的轉(zhuǎn)錄活性，PAX3和SOX10通過他們的DNA結(jié)合位點直接作用協(xié)同激活MITF和c-RET的表達(dá)。

3.3PAX3基因突變致WS發(fā)病的分子機(jī)制研究 多數(shù)研究[8，10，29，32]認(rèn)為突變影響PAX3與DNA結(jié)合活性，導(dǎo)致PAX3蛋白功能降低或喪失，最終以單倍體劑量不足效應(yīng)(haploinsufficiency)導(dǎo)致WS。目前發(fā)現(xiàn)的30多個錯義突變位點幾乎全部位于PD域和HD域，PD域突變通過影響PAX3與DNA的結(jié)合而導(dǎo)致PAX3蛋白功能減弱或喪失，使得其下調(diào)或失去對靶基因表達(dá)的調(diào)控作用[10]。HD域突變通過破壞維持HD域構(gòu)象而影響HD域折疊的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其與DNA結(jié)合[33，34]。無義突變或移碼突變影響PAX3與SOX10相互作用而下調(diào)靶基因MITF表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素合成[7]。Matsunaga[32]通過分析PAX3-DNA復(fù)合體的三維晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測PD域的無義突變可使PAX3與DNA的結(jié)合力減弱或喪失而影響PAX3蛋白功能，進(jìn)而導(dǎo)致WS1。也有研究[8，35]認(rèn)為位于PD和HD的突變可使PAX3蛋白入核動力及亞細(xì)胞定位發(fā)生改變而致蛋白功能下降或喪失，最終導(dǎo)致WS。而位于PD和HD之外的突變不影響PAX3亞細(xì)胞定位，而是通過異位剪切導(dǎo)致PAX3功能不良而致WS。

4 展望

目前PAX3基因?qū)е耊S的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，相關(guān)研究主要以體外實驗分子水平研究為主，不能完全模擬和反映機(jī)體內(nèi)WS的發(fā)生，這需要在體內(nèi)實驗動物水平進(jìn)一步研究WS發(fā)病的分子機(jī)制。NC及NC源性細(xì)胞和組織的發(fā)育是一個十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，盡管PAX3在NC和黑素細(xì)胞發(fā)育過程中調(diào)控作用開始逐步被認(rèn)識，仍有許多問題有待解決，PAX3基因調(diào)控NC發(fā)育的具體機(jī)制、PAX3轉(zhuǎn)錄活性被調(diào)控的機(jī)制、PAX3蛋白化學(xué)修飾對其功能的影響、潛在的PAX3基因調(diào)控的下游靶基因、PAX3基因劑量在WS發(fā)病中的生理病理作用等，有待于逐步闡明，以便更明確地認(rèn)識PAX3基因在NC發(fā)育與WS發(fā)生中的作用。

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