肖文艷，方 磊，吳惠梅，丁佩山，劉榮玉

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

金黃色葡菌球菌刺激巨噬細(xì)胞對JNK活化和Th1/Th2型細(xì)胞因子分泌的影響

肖文艷，方 磊，吳惠梅，丁佩山，劉榮玉

目的探討金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7對c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路活化及其對Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，以金葡菌的感染復(fù)數(shù)（MOI）值為10（金葡菌∶細(xì)胞＝10∶1）刺激RAW264.7細(xì)胞，設(shè)置時間點為0.5、1.0、1.5、2.0h。Western blot檢測金葡菌刺激后RAW264.7細(xì)胞JNK磷酸化水平，ELISA法檢測各時間點RAW264.7細(xì)胞上清液中白介素-5（IL-5）和干擾素-γ（IFN-γ）的表達(dá)水平。結(jié)果金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞后JNK磷酸化水平顯著升高，在0.5h最明顯（P＜0.01）；細(xì)胞上清液中IFN-γ水平在金葡菌刺激后0.5、1.0h顯著升高（P＜0.01），而在1.5、2.0h逐漸恢復(fù)到正常水平（P＞0.05）；IL-5水平在金葡菌刺激后1.0h時開始升高（P＜0.05），并在1.5、2.0h顯著升高（P＜0.01）；另外IL-5/IFN-γ在1.0、1.5、2.0h時差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論金葡菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞能夠活化JNK通路，并影響Th1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)。

巨噬細(xì)胞；JNK；IL-5；IFN-γ

慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等多種肺部疾病的共同病理生理特征，是多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子相互作用所致的氣道病變，在其病理生理過程中，巨噬細(xì)胞起著極其重要的作用。巨噬細(xì)胞在細(xì)菌毒素、煙霧等有害物質(zhì)的刺激下，向肺組織遷移并釋放多種細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-5、IL-4等，這些細(xì)胞因子又可以趨化T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等遷移進(jìn)而導(dǎo)致氣道持續(xù)炎癥和嚴(yán)重?fù)p傷。研究［1］顯示金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）細(xì)胞壁成分肽聚糖可以通過巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體2（Toll-like receptor2，TLR2）介導(dǎo)活化絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）家族的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）信號通路，特別是活化JNK信號通路能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌等病原體的過程［2］，并且活化的JNK信號通路能夠激活下游核轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)釋放多種細(xì)胞因子。因此，該研究擬通過金葡菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞來觀察JNK信號通路的活化及其對IL-5、INF-γ炎性細(xì)胞因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料小鼠單核－巨噬細(xì)胞系RAW264.7購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；金葡菌NCTC8325由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授饋贈；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購于美國Invitrogen公司；胰蛋白胨、酵母提取物購于英國Oxoid公司；氯霉素購于上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司；細(xì)胞裂解液由50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、0.1% SDS、1%Triton X-100、0.25%脫氧膽酸鈉，150 mmol/L氯化鈉和1 mmol/L EDTA配制而成，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購于瑞士Roche公司；磷酸化JNK（p-JNK）、JNK多克隆抗體購于美國CST公司；GAPDH單克隆抗體購于上?？党缮锕?；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購于美國Promega公司；蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于美國Thermo公司；熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于上海歐翔科學(xué)儀器有限公司；奧林巴斯倒置顯微鏡IX70購于日本Olmypus公司；IL-5、IFN-γ ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司（IL-5貨號：CSB-E04637m；IFN-γ貨號：CSBE04578m），IFN-γ試劑盒與IL-5試劑盒檢測范圍分別為15.60～1 000.00 pg/ml和31.25～2 000.00 pg/ml。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，同時添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，每4～5 d根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)傳代1次，保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期生長。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)金葡菌在0.1%氯霉素的LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；NaCl 10 g/L）中培養(yǎng)16h后，取對數(shù)生長期細(xì)菌測定其光密度值（optical density，OD）（OD650＝0.2，約合2×108/ml），用甘油將細(xì)菌凍存，－80℃保存。

1.4 金葡菌刺激細(xì)胞將對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞按1×105/ml的密度分別接種12孔板，培養(yǎng)過夜。PBS清洗金葡菌3次，用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基重懸并稀釋，將濃度調(diào)整至細(xì)胞∶金葡菌＝1∶10，將金葡菌加入細(xì)胞中分別刺激0、0.5、1.0、1.5、2.0h。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞JNK蛋白磷酸化水平

各組細(xì)胞處理如1.4所示，收集上述各組細(xì)胞用PBS漂洗后，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液100 μl，冰上裂解15 min，收集裂解產(chǎn)物，12 000 r/min 4℃離心15 min，將上清液移至新的EP管中，取少量用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，然后加入等體積2×loading buffer混勻，沸水中煮10 min，冷卻后－20℃保存。取25 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）將蛋白分離，再通過轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加相應(yīng)一抗p-JNK和JNK（1∶2 000）4℃過夜后置于室溫1h，TBST洗膜3次，每次15 min，加二抗（1∶2 000）室溫放置1h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL化學(xué)發(fā)光試劑孵育蛋白膜上后放入熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH作為內(nèi)參，p-JNK與JNK灰度值的比值代表各組樣品p-JNK的相對表達(dá)量，同時也反映了JNK的磷酸化水平。

1.6 ELISA測定IL-5和IFN-γ的分泌量收集金葡菌刺激細(xì)胞后的培養(yǎng)基，1 500 r/min 4℃離心15 min，留取上清液，－80℃保存待測。用相應(yīng)ELISA檢測試劑盒，按說明書操作規(guī)范分別檢測細(xì)胞上清中IL-5和IFN-γ的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以ˉ±s表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較時采用Bonferroni檢驗。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的金葡菌刺激巨噬細(xì)胞后，顯微鏡觀察實驗組RAW264.7細(xì)胞與對照組RAW264.7細(xì)胞形態(tài)上的差異。金葡菌在感染巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞開始皺縮變形，并逐漸形成吞噬囊泡進(jìn)而內(nèi)吞金葡菌。見圖1。

圖1 金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞 ×20

2.2 金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞后對p-JNK蛋白表達(dá)量的影響金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞后，Western blot檢測刺激不同時間段RAW264.7細(xì)胞中p-JNK蛋白的表達(dá)量。各時間段，金葡菌刺激后RAW264.7細(xì)胞的p-JNK蛋白表達(dá)量均明顯高于未刺激的RAW264.7細(xì)胞（P＜0.01），且0.5h組相比其余各組，p-JNK蛋白表達(dá)升高的水平最明顯（P＜0.01），見圖2。

2.3 金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞后對IL-5/IFN-γ分泌量的影響金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞后，ELISA檢測刺激不同時間段RAW264.7細(xì)胞上清液中IL-5和IFN-γ的分泌量，金葡菌刺激巨噬細(xì)胞后，1.0h實驗組與對照組IL-5分泌量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），1.5h和2.0h實驗組相比于對照組，IL-5分泌量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；0.5h和1.0h實驗組與對照組IFN-γ分泌量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并且0.5h實驗組分泌量最大（F＝269.064）；對IL-5、IFN-γ的分泌量進(jìn)行相對比較時發(fā)現(xiàn)，隨著刺激時間的延長，IL-5與IFN-γ分泌量的比值（IL-5/IFN-γ）逐漸增大，且1.0、1.5和2.0h實驗組與0.5h實驗組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 處理不同時間的巨噬細(xì)胞分泌IL-5、IFN-γ的表達(dá)（n＝5±s）

表1 處理不同時間的巨噬細(xì)胞分泌IL-5、IFN-γ的表達(dá)（n＝5±s）

與對照組（0h）比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與0.5h比較：＃＃P＜0.01

項目0h0.5h1.0h1.5h2.0h IL-5（pg/ml）20.98±2.3325.41±1.9230.29±3.03*38.16±3.48**50.28±3.69**IFN-γ（pg/ml）14.53±2.2334.04±4.46**25.23±2.60**20.03±2.3416.75±1.94 IL-5/IFN-γ1.45±0.060.75±0.471.20±0.14＃＃1.90±0.10＃＃3.01±0.16＃＃

圖2 Western blot法檢測金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞后對p-JNK蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

氣道防御屏障中的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)在慢性炎癥中起著至關(guān)重要的作用，主要通過吞噬病原體和協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)來調(diào)控天然免疫應(yīng)答從而參與炎癥的慢性化。分布于巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體（TLRs）家族通過識別金葡菌細(xì)胞壁的組分如肽聚糖、脂磷壁酸等后介導(dǎo)下游信號分子JNK的活［3］，JNK信號通路被激活后，胞質(zhì)中的JNK分子移位到細(xì)胞核，可以進(jìn)一步促進(jìn)核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun氨基末端63及73位的絲氨酸殘基磷酸化，激活后的核轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)可以釋放多種細(xì)胞因子參與調(diào)控細(xì)胞的遷移、增殖與分化［4］。另外JNK信號通路還可以通過上調(diào)吞噬相關(guān)基因（如清道夫受體CD36、SR-A）促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌的過程［5］。

本實驗結(jié)果顯示金葡菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞后，JNK磷酸化水平在30 min達(dá)到高峰，與此同時，分泌的IFN-γ水平也達(dá)高峰，這與Oltmanns et al［6］研究相一致。隨著金葡菌刺激時間的延長，JNK磷酸化水平開始降低并伴有IFN-γ分泌的減少，而在整個刺激過程中IL-5的分泌量表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢。另外，該研究通過IL-5與IFN-γ分泌程度的相對比較來看，金葡菌感染的早期炎性細(xì)胞因子主要以IFN-γ為主，而后期IL-5的分泌則逐漸占據(jù)主導(dǎo)的地位，而Masuda et al［7］研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞通過其表面TLR4識別G－菌細(xì)胞壁成分脂多糖后活化JNK信號通路并介導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子（IL-5、IL-10、IL-13）分泌顯著升高，并且IL-5和IL-13能夠下調(diào)巨噬細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ，進(jìn)而加重氣道炎癥，而本研究顯示巨噬細(xì)胞在吞噬金葡菌后同樣能夠活化JNK信號通路并介導(dǎo)IL-5分泌顯著升高。

巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌后完成抗原提呈作用，輔助性T淋巴細(xì)胞（Thelper cells，TH）在抗原提呈細(xì)胞作用下開始活化，同時產(chǎn)生IL-2，活化的TH細(xì)胞在不同細(xì)胞因子環(huán)境下向Th1或Th2轉(zhuǎn)化（IL-4、IL-5促進(jìn)Th2的分化，IL-12、IFN-γ促進(jìn)Th1的分化）。本研究顯示在巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌的后期以IL-5的分泌為主，據(jù)此推測在IL-5微環(huán)境下，TH細(xì)胞傾向于向Th2的分化。另外IL-5可以招募并誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，Eos）分化，JNK信號通路可能涉及到Eos的招募［8］。

Kim et al［9］發(fā)現(xiàn)金葡菌的定植與氣道慢性炎癥密切相關(guān)，金葡菌分泌的超抗原腸毒素具有強(qiáng)大的抗原刺激能力，在極低濃度下即可激活大量的T淋巴細(xì)胞，并且金葡菌細(xì)胞壁成分－肽聚糖和磷壁酸亦為單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞強(qiáng)有力的刺激原，可誘導(dǎo)TNF-α、IFN-γ、IL-5等炎癥介質(zhì)的大量合成與釋放［10］。且近年研究［11］顯示金葡菌與哮喘密切相關(guān)，其分泌出具有超抗原活性的腸毒素不僅能夠調(diào)節(jié)B、T淋巴細(xì)胞功能，還能夠激活其他炎性細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等）。

綜上所述，本研究顯示金葡菌刺激巨噬細(xì)胞后活化JNK信號通路并對炎性細(xì)胞因子IL-5、IFN-γ有調(diào)控作用，提示JNK信號通路可能參與氣道慢性疾病的發(fā)生。

［1］ Bhatt K H，Sodhi A，Chakraborty R.Peptidoglycan induced expression of Peroxisome proliferator-activated receptor γ in mouse peritoneal macrophages：Role of ERK and JNK MAP kinases［J］.Cytokine，2012，60（3）：778－86.

［2］ Wang H，Wu Y，Ojcius D M，et al.Leptospiralhemolysins induce proinflammatory cytokines through toll-like receptor 2-and 4-mediated JNK and NF-κB signaling pathways［J］.PLoS One，2012，7（8）：e42266.

［3］ Watanabe I，Ichiki M，Shiratsuchi A，et al.TLR2-mediated survival of Staphylococcus aureus in macrophages：a novel bacterial strategy againsthost innate immunity［J］.J Immunol，2007，178（8）：4917－25.

［4］ Wuyts W A，Vanaudenaerde B M，Dupont L J，et al.Involvement of p38 MAPK，JNK，p42/p44 ERK and NF-kappaB in IL-1betainduced chemokine release inhuman airway smooth muscle cells［J］.Respir Med，2003，97（7）：811－7.

［5］ Doyle S E，O′Connell R M，Miranda G A，et al.Toll-like receptors induce a phagocytic gene program through p38［J］.J Exp Med，2004，199（1）：81－90.

［6］ Oltmanns U，Issa R，Sukkar M B，et al.Role of c-jun N-terminal kinase in the induced release of GM-CSF，RANTES and IL-8 fromhuman airway smooth muscle cells［J］.Br J Pharmacol，2003，139（6）：1228－34.

［7］ Masuda A，Yoshikai Y，Aiba K，et al.Th2 Cytokine production from mast cells is directly induced by lipopolysaccharide and distinctly regulated by c-Jun N-Terminal kinase and p38 pathways［J］.J Immunol，2002，169（7）：3801－10.

［8］ Kampen G T，Stafford S，Adachi T，et al.Eotaxin induces degranulation and chemotaxis of eosinophils through the activation of ERK2 and p38 mitogen-activated protein kinases［J］.Blood，2000，95（6）：1911－7.

［9］ Kim E S，Kim E C，Lee S M，et al.Bacterial yield from quantitative cultures of bronchoalveolar lavage fluid in patients with pneumonia on antimicrobial therapy［J］.Korean J Intern Med，2012，27（2）：156－62.

［10］姚詠明，盛志勇.重視金黃色葡萄球菌膿毒癥的研究［J］.中華燒傷雜志，2000，16（2）：75－7.

［11］Bachert C，Zhang N，Patou J，et al.Role of staphylococcal superantigens in upper airway disease［J］.Curr Opin Allergy Clin Immunol，2008，8（1）：34－8.

Effects of Staphylococcus aureus on the activation of JNK and secretion of Th1/Th2 cytokines in murine macrophage

Xiao Wenyan，F(xiàn)ang Lei，Wu Huimei，et al
（Dept of Pulmonary，Anhui Geriatrics Institute，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects on c-Jun amino-terminal kinase（JNK）expression and Th1/Th2 cytokines secretion from mouse macrophage cell line RAW264.7 stimulated by Staphylococcus aureus（S.aureus）.MethodsRAW264.7 cells were cultured in vitro，then were stimulated by S.aureus at a multiplicity of infection（MOI）of 10（S.aureus∶cells＝10∶1）for 0.5，1.0，1.5 and 2.0h respectively.The protein expression of p-JNK was analyzed by Western blot，the levels of interleukin-5（IL-5）and interferon-γ（IFN-γ）in the supernatants of each group were analyzed by ELISA.ResultsAfter stimulating by S.aureus，the level of JNK phosphorylation was significantly increased and was maximized at 0.5h（P＜0.01）；the level of IFN-γ was significantly increased at 0.5，1.0h（P＜0.01），but back to normal level at 1.5 and 2.0h（P＞0.05）；IL-5 began to increase at 1.0h and 1.5h（P＜0.05），and was significantlyhigher at 2.0h（P＜0.01）；additionally，the ratio of IL-5/IFN-γ was significantly increased at 1.0，1.5 and 2.0h（P＜0.01）.ConclusionS.aureus stimulation activates JNK signaling and regulates the balance of Th1/Th2 cytokines in murine macrophages.

macrophage；c-Jun amino-terminal kinase；interleukin-5；interferon-γ

R 562.2＋5；Q 241；Q 74

A

1000－1492（2014）04－0423－04

2014－02－17接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81270083、81170030）；安徽省重點實驗室計劃項目（編號：1206c0805028）；安徽省科技攻關(guān)項目（編號：12010402135）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部呼吸科，安徽省老年病研究所，合肥 230022

肖文艷，男，碩士研究生；劉榮玉，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：rongyuliu＠gmail.com