吳智明，石開虎，吳君旭，徐盛松，陶 輝，宣海洋，曹 煒，沙紀名，占紅英

風濕性心臟瓣膜病合并心房顫動患者中SK2與CX40蛋白的表達變化及相關(guān)性

吳智明，石開虎，吳君旭，徐盛松，陶 輝，宣海洋，曹 煒，沙紀名，占紅英

目的探討風濕性心臟瓣膜病（簡稱風心?。┖喜⑿姆款潉樱ˋF）患者2型小電導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白（SK2）與縫隙連接蛋白40（CX40）表達水平變化及其相關(guān)性。方法

風濕性心臟??；心房顫動；縫隙連接蛋白；小電導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白

風濕性心臟瓣膜疾?。ê喎Q風心病）合并心房顫動（atrial fibrillation，AF）是心臟外科常見的臨床疾病。近年來發(fā)現(xiàn)2型小電導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白（SK2）在心肌細胞復(fù)極化的過程中起到非常重要的作用，且與AF具有一定相關(guān)性［1－3］。AF早期出現(xiàn)的電重構(gòu)是容易逆轉(zhuǎn)的電生理現(xiàn)象，后期則出現(xiàn)不可逆的結(jié)構(gòu)重構(gòu)現(xiàn)象，這又被稱作“快速心率引起的心房肌病”［4］。心肌間的結(jié)構(gòu)藕聯(lián)是由縫隙連接蛋白（CX）組成，心肌間電激動很大程度取決于CX。心房肌細胞主要表達CX40、CX43等。而CX40是心房肌細胞最主要的藕聯(lián)蛋白，CX40結(jié)構(gòu)重構(gòu)與AF的發(fā)生及穩(wěn)定性密切相關(guān)。該研究通過對風心病合并AF患者的右心耳CX40、SK2蛋白表達進行對比分析，探討CX40、SK2對AF的影響，從而揭示風心病患者AF發(fā)生與維持的可能機制，為臨床更好地防治AF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年2月～2013年2月在我院因風心病施行心臟瓣膜置換手術(shù)的31例患者，排除合并高血壓、糖尿病、心絞痛和慢性腎功能不全者。按有無AF分為AF組和竇性心律（SR）組。AF組20例，其中男9例，女11例，年齡29～70歲，平均41.62歲；術(shù)前NYHA心功能分級Ⅰ級0例，Ⅱ級5例，Ⅲ級9例，Ⅳ級6例。SR組11例，其中男4例，女7例，年齡32～68歲，平均35.42歲；術(shù)前NYHA心功能分級Ⅰ級1例，Ⅱ級7例，Ⅲ級3例。

1.2 主要試劑人KCNN2 ELISA試劑盒、人CX40 ELISA試劑盒（美國Uscn公司）；兔抗CX40多克隆抗體（美國Millipore公司）；兔抗SK2多克隆抗體（Alomone公司）。

1.3 方法

1.3.1 心臟彩超檢查 在患者術(shù)前行心臟彩超檢查。儀器：MYLAB50頻率3.5 mHz。記錄反映心功能的參數(shù)：左室射血分數(shù)（LVEF）。記錄心臟若干結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：左房內(nèi)徑（LAD）、右房內(nèi)徑（RAD）、左室舒張末期直徑（LVDD）、右室內(nèi)徑（RVD）。

1.3.2 ELISA測定蛋白

1.3.2.1 膜蛋白的提取 組織剪碎加入1 ml蛋白提取液，液氮研磨，冰上孵育30 min，4℃，2 600 r/min離心5 min，取上清液。

1.3.2.2 ELISA試驗 ①加樣：依次將標準品、待測樣品100 μl加入到酶標板中，蓋上覆膜，37℃溫育30 min；②加試劑A：棄去孔內(nèi)液體，每孔加試劑A 100 μl，酶標板加上覆膜，37℃溫育1h；③洗滌：棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μl洗滌液洗滌，浸泡1～2 min，棄去孔內(nèi)液體，拍干，如此重復(fù)5次；④加試劑B：每孔加入試劑B 100 μl，酶標板加上覆膜，37℃溫育30 min；⑤洗滌：同步驟3；⑥顯色：每孔加底物溶液90 μl，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色10～15 min；⑦終止：每孔加終止溶液50 μl終止反應(yīng)，此時溶液由藍色立即轉(zhuǎn)為黃色。終止液的加入順序和底物溶液的加入順序相同，在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡15 min內(nèi)，立即用酶標儀在450 nm波長測定各孔的吸光度（OD）值。

1.3.3 Western blot法測定蛋白 心房肌蛋白提?。喝∮倚亩男姆考〗M織塊1 g，加入總蛋白提取液1 ml，勻漿、裂解、離心，即得總蛋白提取液，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。①蛋白電泳：采?2%分離膠及5%積層膠的SDS-PAGE系統(tǒng)；②轉(zhuǎn)膜：300 mA恒流電2h；③印跡：洗膜；一抗工作液，37℃孵育過夜，洗膜；二抗工作液，37℃孵育2h，洗膜；④洗片：將A和B發(fā)光液按等體積混合滴于PVDF膜上，壓片，曝光，定影；⑤蛋白半定量檢測：采用Lab Works4.5圖像獲取和分析系統(tǒng)軟件測定CX40、SK2蛋白條帶的積分光密度（IOD）值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照，每個樣品均同時檢測GAPDH蛋白條帶的IOD值，SK2、CX40的相對表達量以IODSK2/IODGAPDH、IODCX40/IODGAPDH值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用±s表示。兩組之間定量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 基本資料AF組患者平均年齡大、病程長，與SR組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；彩色多普勒超聲心動圖資料顯示：AF組LAD、RAD、LVDD平均值明顯大于SR組（P＜0.01），但LVEF平均值明顯小于SR組（P＜0.01），見表1。

表1 心功能各項指標（±s）

表1 心功能各項指標（±s）

與SR組比較：**P＜0.01

項目AF組（n＝20）SR組（n＝11）年齡（歲）41.86±11.53**35.42±10.30性別（男/女）9/114/7病程（年）14.05±9.71**7.45±7.13 LVDD（mm）54.12±7.01**50.81±8.90 LAD（mm）52.93±11.02**41.89±8.43 RVD（mm）19.55±2.8217.77±2.88 RAD（mm）49.20±5.81**47.51±6.32 LVEF0.51±0.08**0.57±0.09

2.2 ELISA法檢測由圖1A ELISA標準曲線可間接得出，每孔樣品量總蛋白為0.1 mg的條件下，AF組患者心房肌細胞SK2蛋白濃度為（4.01± 0.47）ng/ml，SR組患者心房肌細胞SK2蛋白濃度為（1.23±0.13）ng/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。由圖1B可知，AF患者心房肌細胞CX40蛋白濃度為（5.38±0.45）ng/ml，SR組患者心房肌細胞CX40蛋白濃度為（8.92±0.78）ng/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 ELISA標準曲線

2.3 Western blot法檢測與SR組相比較，AF組右心房SK2蛋白的相對表達量明顯增加（P＜0.01），而AF組右心房CX40的相對表達量明顯減少（P＜0.01），見圖2。

2.4 SK2與CX40的相關(guān)性分析AF的電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)可能存在相互作用，即SK2與CX40蛋白水平相關(guān)性研究可能揭示電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)的關(guān)系，分析結(jié)果：CX40蛋白水平與SK2蛋白水平呈負相關(guān)（r＝－0.56，P＜0.01）。

3 討論

AF的發(fā)生不僅與心房肌細胞動作電位不應(yīng)期縮短有密切關(guān)系，還與心肌細胞間的電藕聯(lián)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。心房電重構(gòu)是導(dǎo)致心律失常基質(zhì)產(chǎn)生的重要原因，亦導(dǎo)致AF的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)［5－6］。心房肌細胞動作電位的去極化與復(fù)極化過程則由心肌細胞膜上不同的離子通道開閉程度所決定的，其中SK2蛋白在心房肌細胞動作電位末期起到非常重要的作用，并發(fā)現(xiàn)SK2蛋白在心房組織表達量明顯高于心室組織［1］。而縫隙連接作為心肌細胞間實現(xiàn)電藕聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與了AF的發(fā)生、發(fā)展及維持。研究［7］表明CX40其含量和分布與AF密切相關(guān)。

圖2 Western blot法檢測SK2、CX40蛋白的表達

本研究通過ELISA、Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)風心病合并AF患者右心耳心房肌組織SK2蛋白表達量較SR組明顯增加，與Ozgen et al［3］在兔肺靜脈經(jīng)過間歇的短陣高速起搏的肺靜脈肌細胞SK2通道研究結(jié)果類似。心房肌細胞SK2蛋白增加，會導(dǎo)致心肌細胞動作電位復(fù)極時程縮短，而心肌細胞動作電位復(fù)極時程縮短又是引起AF的重要因素。此外，研究［8］顯示SK2阻滯劑NS8593可以延長心房的有效不應(yīng)期，但不影響心室激動時間，并且能預(yù)防和終止離體或在體的AF模型。李妙齡等［9］研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)性AF患者的右心耳SK2通道電流明顯增加。持續(xù)性AF患者心房肌細胞SK2通道電流的增強，揭示了SK2可能參與和介導(dǎo)AF的心房電重構(gòu)過程。

Kostin et al［7］對AF頻繁發(fā)作患者行迷宮手術(shù)時，留取的右心房組織進行分析后發(fā)現(xiàn)CX40的表達水平明顯下降；Nao et al［10］對風心病行瓣膜置換術(shù)患者的右心耳行CX定量檢測中發(fā)現(xiàn)AF組CX40表達量較SR組明顯減少，但CX40的絲氨酸磷酸基的表達卻增高。另外，黃驥等［11］對31例風心病行瓣膜置換術(shù)患者的左、右心耳CX40表達進行對比研究后發(fā)現(xiàn)，左、右心房CX40表達量比SR組明顯降低，這都與本研究結(jié)果類似。因此，CX40降解及重新分布，蓄積于胞質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致縫隙連接的中斷、功能障礙，引起心肌間電藕聯(lián)障礙，造成激動時電活動橫向傳導(dǎo)失藕聯(lián)，以及不同傳導(dǎo)方向的不應(yīng)期差異，從而產(chǎn)生興奮的折返導(dǎo)致AF的發(fā)生［12－13］。

本研究還發(fā)現(xiàn)SK2與CX40呈負相關(guān)性，其可能原因是在慢性AF中擴張的右心房導(dǎo)致心房肌細胞增大，引起CX40降解和分布異常，導(dǎo)致縫隙連接的功能失常。另外，心房肌細胞SK2蛋白增多使得心房肌細胞動作電位復(fù)極時程縮短［3］，導(dǎo)致房內(nèi)小折返回路，同時組織結(jié)構(gòu)異質(zhì)性使傳導(dǎo)延遲，更多子波折返，兩種機制正反饋的促進AF的發(fā)生、發(fā)展和維持。

綜上所述，AF的電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)可能存在相互影響，并促進AF的發(fā)生和維持。由SK2和CX40在心房組織和心室組織的表達不同［1，14］，為臨床新藥的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。通過藥物阻斷SK2通道，直接針對心房肌細胞而不影響心室肌細胞的電活動，減少傳統(tǒng)抗心律失常藥物引起的副作用；或者以CX40為作用靶點開發(fā)藥物，以緩解或阻止心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展，從而達到治療及預(yù)防AF的臨床目的。

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Study on expression of SK2 and CX40 in the patients with rheumaticheart disease and atrial fibrillation

Wu Zhiming，Shi Kaihu，Wu Junxu，et al
（Dept of Cardiothoracic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the influence of atrial fibrillation（AF）to SK2 and CX40 in right atrial myocytes when the patients with rheumaticheart disease suffered from AF or not.MethodsWe investigated 31 patients with rheumaticheart disease undergoing cardiac surgery for correction to valvular defect.According to the duration of AF，20 patients with AF were experimental group；11 without AF were control group.Expression of SK2 and CX40 was detected by ELISA and Western blot.ResultsELISA showed that compared with the control group，concentration of SK2 protein in experimental group washigher（P＜0.01）.But the level of CX40 was markedly decreased in experimental group（P＜0.01）.The results of Western blot were similar to those of ELISA.Correlation analysis showed the expression of SK2 and CX40 took on negative correlation（r＝－0.56，P＜0.01）.ConclusionThehigher expression level of SK2 and down-regulation of level of CX40 can be an important agent in the occurrence and maintenance of the rheumaticheart disease with atrial fibrillation.In addition，expression of SK2 and CX40 takes on negative correlation.

rheumaticheart disease；atrial fibrillation；connexin；small-conductance calcium-activated potassium channels

R 541.2；R 541.75；R 341.7；R 329.251

A

1000－1492（2014）04－0460－04

2013－10－16接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1308085MH117）；安徽省高等教育自然科學(xué)基金（編號：KJ2011A175）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，合肥 230601

吳智明，男，碩士研究生；石開虎，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：shikaihu＠gmail.com

將31例風心病接受瓣膜置換手術(shù)患者，于體外循環(huán)前切取的右心耳組織作為研究對象，根據(jù)AF的定義將標本分為兩組：AF組（n＝20）和竇性心律（SR）組（n＝11），分別利用ELISA、Western blot法檢測心房肌組織中SK2和CX40蛋白表達水平變化。結(jié)果ELISA法檢測顯示AF組與SR組相比，SK2蛋白表達增加（P＜0.01）；而CX40蛋白表達減少（P＜0.01）。同時，Western blot法檢測顯示AF組與SR組相比，SK2蛋白表達增加（P＜0.01），而CX40蛋白表達減少（P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示SK2與CX40之間呈負相關(guān)（r＝－0.56，P＜0.01）。結(jié)論SK2與CX40蛋白參與風心病合并AF的病理過程。此外，SK2和CX40之間存在一定負相關(guān)性。