王 玲，朱秀清，李佳棟，許 慧，鄭環(huán)宇，吳海波

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是以低溫脫脂豆粕為原料，經(jīng)堿提酸沉工藝制取的一種蛋白質(zhì)含量在90%以上的大豆蛋白產(chǎn)品[1]，是一種全價(jià)蛋白類(lèi)食品添加劑。SPI憑其資源豐富，原料成本低等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中。隨著生活節(jié)奏的加快和生活水平的不斷提高，一些方便快捷的冷凍食品，如冷凍肉丸、冷凍肉餡等深受人們的喜愛(ài)，使得大豆分離蛋白在冷凍食品應(yīng)用中的市場(chǎng)前景更加廣闊。將SPI添加到冷凍肉制品中，利用SPI自身的功能性質(zhì)，有利于在加工過(guò)程中發(fā)揮各種冷凍肉制品的理化性質(zhì)。但是SPI在冷凍條件下，由于蛋白質(zhì)分子多肽鏈特有的有規(guī)則排列發(fā)生變化成為較混亂的排列[2]，會(huì)發(fā)生不可逆的凍結(jié)變性[3]。石彥國(guó)等[4]研究發(fā)現(xiàn)將粉末狀大豆蛋白配制成溶液后進(jìn)行凍結(jié)，并在-1～-3 ℃條件下冷藏，解凍后部分大豆蛋白出現(xiàn)絮狀不融現(xiàn)象；Pikal-Cleland[5]得出在凍藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子間由于氫鍵、疏水鍵、二硫鍵、鹽鍵等的形成而聚集變性，從而導(dǎo)致鹽溶性蛋白的溶解度下降。大豆蛋白的冷凍變性，直接影響了SPI在冷凍食品中功能性的發(fā)揮。因此，研究冷凍過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，有助于深入了解大豆蛋白的冷凍變性機(jī)理，進(jìn)而可以明確SPI的結(jié)構(gòu)變化對(duì)其功能性的影響，無(wú)論從理論還是實(shí)際來(lái)說(shuō)，都有一定的指導(dǎo)意義。巰基與二硫鍵是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)重要的組成部分[6]，通過(guò)其含量的變化情況來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，是最有效便捷的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合已有的方法和結(jié)果，探討低溫冷凍條件對(duì)SPI結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；β-巰基乙醇（分析純） 美國(guó)Amresco公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）、Ellman試劑（優(yōu)級(jí)純）、5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽（分析純）、1-苯胺基-8-萘磺酸（分析純） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司； BC-169海爾雙王子電冰箱 青島海爾電冰箱股份有限公司；4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白基本成分的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》）；粗脂肪含量測(cè)定：索氏提取法（GB/T 5512—2008《糧油檢驗(yàn) 糧食中粗脂肪含量測(cè)定》）；灰分測(cè)定：GB/T 22510—2008《谷物、豆類(lèi)及副產(chǎn)品灰分含量的測(cè)定》；水分測(cè)定：GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；粗纖維含量的測(cè)定：GB 5009.10—2003《植物類(lèi)食品中粗纖維的測(cè)定》。

1.3.2 大豆分離蛋白冷凍樣品的制備

將干燥的SPI樣品與水以不同比例混合，攪拌均勻后，于室溫下靜置20 min后送入冰箱內(nèi)冷凍。將冷凍后的SPI，在水中解凍，解凍后的樣品放入鼓風(fēng)干燥箱中低溫烘干，將烘干后的固體粉碎，制成粉末狀樣品，備用。

1.3.3 巰基和二硫鍵含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)的巰基含量的測(cè)定，是根據(jù)Ellman[7]提出的理論，參照Tang[9]采用的5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽滴定方法，在412nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。按照式（1）計(jì)算巰基含量。

式中：X為摩爾消光系數(shù)（73.53）；A412nm為溶液在412 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定的吸光度；ρ為樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）[8]。

暴露巰基是指在SPI未變性的狀態(tài)下，埋藏于蛋白分子內(nèi)部與外界極性環(huán)境不相互作用的巰基基團(tuán)。按照式（2）計(jì)算暴露巰基含量和二硫鍵含量。

1.3.4 表面疏水性的測(cè)定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針?lè)y(cè)定蛋白質(zhì)表面疏水性[10]。將蛋白質(zhì)樣品溶于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液中，配成質(zhì)量濃度0.012 5～0.1 g/100 mL的溶液。取一定量的ANS固體，溶于相同的pH 7.0的磷酸緩沖液中，制成8.0 mmol/L的ANS溶液，取25 μL的ANS溶液添加到5 mL的樣品溶液中，避光反應(yīng)15 min在激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)射波長(zhǎng)490 nm的條件下測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度，以SPI添加量和熒光強(qiáng)度作圖，斜率即為表面疏水性。

1.3.5 冷凍條件下SPI添加量對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響

在冷凍時(shí)間為72 h、冷凍溫度為-18 ℃的條件下，考察冷SPI添加量對(duì)SPI的游離巰基、暴露巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響。

1.3.6 冷凍溫度對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響

在冷凍時(shí)間為72 h、SPI與水質(zhì)量比為1∶12的條件下，考察冷凍溫度的變化對(duì)SPI的游離巰基、暴露巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響。

1.3.7 冷凍時(shí)間對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響

在冷凍溫度為-18 ℃、SPI與水質(zhì)量比1∶12的條件下，考察冷凍時(shí)間的變化對(duì)SPI的游離巰基、暴露巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

所有數(shù)據(jù)均通過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn)得到，采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白的成分

表1 大豆分離蛋白成分分析（ ±s）Table 1 Composition analysis of soy protein isolate （ ±s）

表1 大豆分離蛋白成分分析（ ±s）Table 1 Composition analysis of soy protein isolate （ ±s）

成分 水分 粗脂肪 蛋白質(zhì) 灰分 粗纖維含量/% 3.42±0.17 0.07±0.0290.51±0.235.24±0.11 0.26±0.08

由表1可知，SPI的蛋白質(zhì)含量（干基）可達(dá)到90%以上，含量豐富，因此研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)提高和改善SPI在食品應(yīng)用中的功能性具有重要意義。

2.2 冷凍條件下SPI添加量對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響

由圖1可知，隨著SPI添加量的降低，游離巰基逐漸減少，即SPI與水質(zhì)量比由1∶8降低至1∶16時(shí)，此時(shí)冷凍后SPI的游離巰基為由5.04 μmol/g減小到2.84 μmol/g，冷凍后的SPI樣品與未冷凍的對(duì)照組樣品相比，游離巰基含量均降低。這是由于大豆蛋白中的巰基具有較強(qiáng)的極性，能夠借助氫鍵與分子間相互作用，把極性的水分子吸附到蛋白分子周?chē)?，在冷凍凍結(jié)作用下，水分子的氫鍵斷裂，破壞了水分子與巰基之間的平衡作用，游離在蛋白表面的巰基失去依靠，進(jìn)而轉(zhuǎn)換為二硫鍵或形成其他作用力[11]。

圖1 SPI添加量對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響Fig.1 Effect of SPI/water ratio on the contents of sulfhydryl group and disulfide bond and surface hydrophobic ity of SPI

在冷凍環(huán)境下隨著大豆蛋白添加量的逐漸降低，SPI的暴露巰基呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢(shì)，當(dāng)SPI與水的質(zhì)量比為1∶8～1∶12時(shí)，暴露巰基的含量由6.55 μmol/g增加到8.7 μmol/g，當(dāng)SPI與水的質(zhì)量比為1∶12～1∶16時(shí)，暴露巰基的含量由8.7 μmol/g減小至5.74 μmol/g。這可能是由于SPI添加量較高時(shí)，蛋白分子間的間距較小，臨近的蛋白質(zhì)之間交織形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，因冷凍作用暴露出的巰基隱藏在重新形成的蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部[12]；當(dāng)SPI濃度較低時(shí)，雖然蛋白肽鏈因冷凍作用而得到充分伸展，內(nèi)部巰基大量暴露，但SPI添加量低，蛋白分子被水分子嚴(yán)密包裹，所以檢測(cè)到暴露巰基含量較少。

經(jīng)過(guò)冷凍的大豆蛋白的二硫鍵含量均顯著高于對(duì)照組，可以得出冷凍后的SPI結(jié)構(gòu)上主要以二硫鍵的形式存在[13]。隨著大豆蛋白濃度的逐漸降低，二硫鍵的含量也逐漸呈現(xiàn)降低，當(dāng)SPI與水的質(zhì)量比為1∶8時(shí)，二硫鍵含量為最大值28.54 μmol/g，當(dāng)SPI與水的質(zhì)量比為1∶16時(shí)，二硫鍵含量最小為18.66 μmol/g。冷凍作用下SPI的游離巰基和暴露巰基減少，是因?yàn)樵诶鋬鲞^(guò)程中發(fā)生緩慢氧化，巰基形成二硫鍵，導(dǎo)致冷凍后檢測(cè)到的二硫鍵含量大于未冷凍的SPI。

疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，它對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能性質(zhì)具有重要的作用。而表面疏水性由于分子間的相互作用，比整體疏水性對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響更大[14]。蛋白質(zhì)的表面疏水性是與外界極性水環(huán)境相連的蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)數(shù)量的一個(gè)重要標(biāo)志[15-16]。隨著SPI添加量的減小，表面疏水性先增加后減小，當(dāng)SPI與水的質(zhì)量比為由1∶8減至1∶12時(shí)，表面疏水性由257.34增至355.47，當(dāng)SPI與水的質(zhì)量比為由1∶12減至1∶16時(shí)，表面疏水性又減至200.11。冷凍SPI的表面疏水性均大于對(duì)照組SPI，說(shuō)明冷凍能夠增加SPI的表面疏水性，這與Noh等[17]的結(jié)論一致，認(rèn)為大豆蛋白的氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷詺埢峭ㄟ^(guò)疏水鍵相互結(jié)合于蛋白質(zhì)分子中心，形成疏水性區(qū)域，在冷凍變性作用下，蛋白疏水性區(qū)域內(nèi)的氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷詺埢┞冻鰜?lái)，通過(guò)ANS熒光檢測(cè)，冷凍后的蛋白質(zhì)分子的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。

2.3 冷凍溫度對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響

圖2 冷凍溫度對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響Fig.2 Effect of freezing temperature on the contents of sulfhydryl group and disulfide bond and surface hydrophobicity of SPI

由圖2可知，在較高的冷凍溫度下SPI的游離巰基含量較大，與對(duì)照組接近，即未冷凍SPI和-12 ℃的游離巰基含量分別為5.17、5.29 μmol/g，隨著冷凍溫度降低，游離巰基的含量越小，與未冷凍SPI之間的差異越大。表明較低的冷凍溫度能夠顯著改變大豆蛋白游離巰基含量[18-19]，并且促使游離巰基含量朝著減小的趨勢(shì)變化。

在較低冷凍溫度下，不同的冷凍溫度水平對(duì)暴露巰基含量的影響差異不顯著（P＞0.05），在-12 ℃和-15 ℃時(shí)，暴露巰基含量分別為8.13、8.07 μmol/g，而未冷凍SPI的暴露巰基含量為5.35 μmol/g，不同冷凍溫度對(duì)暴露巰基含量的影響與對(duì)照組之間差異顯著（P＜0.05）。

二硫鍵含量的變化趨勢(shì)與暴露巰基相同，均大于未冷凍SPI，在-12 ℃和-15 ℃兩個(gè)溫度水平上，二硫鍵含量分別為26.42 μmol/g和28.51 μmol/g，明顯大于對(duì)照組的18.63 μmol/g，表明冷凍處理能夠有效增加大豆蛋白二硫鍵的含量。

隨著冷凍溫度的降低，SPI的表面疏水性先增加后降低，在-18 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，表面疏水性最大。-12 ℃時(shí)表面疏水性較小，其原因是冷凍作用下大豆蛋白分子的疏水性殘基有效地暴露出來(lái),分子伸展開(kāi)，理論上表面疏水性是明顯增強(qiáng)的[20]，但在起初不太低的冷凍溫度下，大豆蛋白溶液冷凍濃縮時(shí)間延長(zhǎng)，水形成冰晶的時(shí)間增加，導(dǎo)致冰晶顆粒較大[21]，由于機(jī)械破壞作用，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，原來(lái)展開(kāi)的肽鏈重新聚集，部分疏水性基團(tuán)埋藏于蛋白分子內(nèi)部，使得表面疏水性降低[22]。隨著冷凍溫度的降低，機(jī)械破壞作用減小，當(dāng)冷凍溫度達(dá)到-18 ℃時(shí)，蛋白分子暴露的疏水性基團(tuán)最多，表面疏水性最大，當(dāng)冷凍溫度繼續(xù)低至-20 ℃時(shí)，破壞了在-18 ℃時(shí)所保持的肽鏈伸展?fàn)顟B(tài)，因更低溫度的影響，使得暴露在外部的疏水性氨基酸殘基減少，表面疏水性降低。

2.4 冷凍時(shí)間對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響

在冷凍溫度為-18 ℃、SPI與水的質(zhì)量比為1∶12的條件下，考察冷凍時(shí)間的變化對(duì)SPI的游離巰基、暴露巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響。

圖3 冷凍時(shí)間對(duì)SPI巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響Fig.3 Effect of freezing time on the contents of sulfhydryl group and disulfide bond and surface hydrophobicity of SPI

由圖3可知，與未冷凍SPI相比，冷凍后的SPI，游離巰基含量整體呈下降趨勢(shì)。在其他冷凍參數(shù)恒定時(shí)，隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI游離巰基的含量減少，在冷凍72 h時(shí)，巰基含量比對(duì)照組減少了3/4，其含量為4.15 μmol/g，但是冷凍24 h時(shí)，游離巰基含量卻出現(xiàn)比對(duì)照組略有增加的現(xiàn)象，其增幅不顯著，可能是由于SPI在初期冷凍時(shí)，蛋白質(zhì)體系不穩(wěn)定，各種化學(xué)鍵和分子間作用力發(fā)生不同的變化，導(dǎo)致在冷凍時(shí)間較短的情況下，SPI的游離巰基含量會(huì)略高于對(duì)照組。

冷凍時(shí)間對(duì)SPI暴露巰基的影響與游離巰基相反，隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，暴露巰基含量增加，冷凍時(shí)間延長(zhǎng)到72 h時(shí)，暴露巰基含量達(dá)到了最大值為8.89 μmol/g，冷凍時(shí)間越短，暴露巰基含量越少，但都大于對(duì)照組的5.35 μmol/g的暴露巰基含量。

隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI的二硫鍵逐漸增加，其增幅不顯著，冷凍24～72 h，SPI的二硫鍵含量從22.76 μmol/g增至25.08 μmol/g，其變化量只有2.32 μmol/g。而未冷凍SPI的二硫鍵含量18.63 μmol/g，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，冷凍時(shí)間對(duì)SPI二硫鍵影響不大。

在本實(shí)驗(yàn)考察的冷凍時(shí)間范圍內(nèi)，隨著冷凍時(shí)間的增加，SPI的表面疏水性呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢(shì)。在冷凍時(shí)間分別為24、48、72 h時(shí)，表面疏水性分別是548.47、699.93和639.47，其中冷凍48 h時(shí)的表面疏水性最大，并且與冷凍24 h和72 h之間差異顯著（P＜0.05）。因?yàn)槔鋬鲞^(guò)程實(shí)際上就是對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞的過(guò)程，在適合的冷凍條件范圍內(nèi)，天然的蛋白分子折疊形成的疏水區(qū)域中的疏水性氨基酸側(cè)鏈因冷凍破壞作用暴露在分子表面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，冷凍48 h時(shí)暴露疏水性基團(tuán)最多，表面疏水性最大；當(dāng)繼續(xù)冷凍至72 h時(shí)，由于時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到進(jìn)一步破壞，一部分表面巰基可能在儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)的情況下發(fā)生氧化作用，形成表面二硫鍵，使得蛋白分子表面的疏水性基團(tuán)減少，所以通過(guò)ANS熒光檢測(cè)時(shí)，熒光強(qiáng)度變小，表面疏水性減小。

2.5 冷凍后大豆分離蛋白狀態(tài)與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

大豆分離蛋白分散液經(jīng)過(guò)冷凍貯存后，會(huì)出現(xiàn)不可逆的“絮凝”現(xiàn)象。這一現(xiàn)象的產(chǎn)生與SPI的巰基、二硫鍵和表面疏水性的變化密切相關(guān)。原因在于冷凍過(guò)程使得大豆分離蛋白發(fā)生不可逆變性，蛋白大分子空間三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，蛋白分子展開(kāi)，分子內(nèi)二硫鍵斷裂，分子表面的巰基重新分布，SPI與水分子結(jié)合并發(fā)生氧化作用，分子內(nèi)二硫鍵形成分子間二硫鍵，由于SPI暴露出來(lái)的巰基與水分子的結(jié)合作用，使解凍后的SPI結(jié)構(gòu)變得膨脹而松散，即形成了絮凝狀態(tài)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)冷凍條件下SPI的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析了冷凍過(guò)程中SPI的巰基、二硫鍵及表面疏水性隨SPI添加量、冷凍溫度和冷凍時(shí)間的變化情況，由實(shí)驗(yàn)得出隨SPI添加量減小、冷凍溫度降低和冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI的巰基、二硫鍵、表面疏水性與未冷凍SPI相比均減小，其結(jié)構(gòu)在不同因素水平之間差異較大。SPI與水的質(zhì)量比為1∶8和1∶16時(shí)，二硫鍵含量分別取得最大和最小值，其值分別為28.54、18.66 μmol/g；冷凍溫度為-12 ℃時(shí)，巰基和二硫鍵含量最大，表面疏水性較小，-18 ℃時(shí)，表面疏水性達(dá)到最大；冷凍24 h時(shí)SPI的游離巰基含量最大，冷凍72 h時(shí)，游離巰基含量最小為4.15 μmol/g。可知冷凍條件變化時(shí)，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

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