劉倩 綜述 吳菁 審校

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 510010）

脊髓性肌萎縮的診療進(jìn)展

劉倩 綜述 吳菁 審校

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 510010）

脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）是一種基因突變導(dǎo)致脊髓前角細(xì)胞變性引起肌無(wú)力和肌萎縮等臨床癥狀的一組疾病。遺傳方式以常染色體隱性遺傳為主，也有常染色體顯性遺傳和X連鎖遺傳［1，2］的報(bào)道。活產(chǎn)兒中發(fā)病率約為1/6000～1/10 000，是第二常見(jiàn)的致死性常染色體隱性遺傳病，僅次于囊性纖維化。文獻(xiàn)顯示，中國(guó)南方SMA致病基因SMN1攜帶者率為1/35～1/80［3］，與國(guó)外學(xué)者［4］報(bào)道的攜帶者發(fā)生率1/40～1/60相似。SMA的診斷過(guò)程復(fù)雜，缺乏有效的治療辦法，防治SMA的有效途徑是進(jìn)行產(chǎn)前診斷，避免患兒的出生，或通過(guò)輔助生育技術(shù)進(jìn)行植入前診斷。現(xiàn)就該病的診斷與治療進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 臨床表現(xiàn)與分型

SMA臨床上主要表現(xiàn)為肌肉萎縮和肌張力減低進(jìn)行性加重。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度及發(fā)病年齡，1992年歐洲神經(jīng)肌肉疾病中心召開(kāi)的SMA國(guó)際研討會(huì)將其分為4型。

1.1 Ⅰ型 嬰兒型，又稱(chēng)Wardning-Hoffmann病，多于出生后6個(gè)月內(nèi)發(fā)病，起病急、病程進(jìn)展快，表現(xiàn)為嚴(yán)重的全身肌無(wú)力和肌張力不全，不能獨(dú)坐或行走，常于2歲內(nèi)死于呼吸麻痹或肺部感染等。

1.2 Ⅱ型 中間型，通常在出生后6～18個(gè)月起病，患兒可獨(dú)坐，但不能獨(dú)自站立或行走，多數(shù)可存活至2歲以后。

1.3 Ⅲ型 少年型，又稱(chēng)Kugelberg-Welander病，常于2～17歲起病，多數(shù)僅表現(xiàn)為輕度肌力減弱，可獨(dú)自站立和行走。起病后逐漸失去行走能力，病程進(jìn)展緩慢，可存活至成年。

1.4 Ⅳ型 成年型，一般于30歲以后發(fā)病，表現(xiàn)為緩慢逐漸發(fā)生的上下肢近端無(wú)力和肌萎縮，有肌震顫，以骨盆帶肌和肩胛帶肌為著，出現(xiàn)上樓困難以及梳頭無(wú)力等。40歲以后才發(fā)病者可累及肢體遠(yuǎn)端。

2 分子遺傳學(xué)和病因

1990年Brzutowicz等［5］將SMA的致病基因定位于5q11.2～q13.3。1995年Lefebvre等［6］學(xué)者在該基因座區(qū)域檢測(cè)到4個(gè)不同的c DNA克隆，證實(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（survival motor neuron，SMN）是致病基因。SMN基因全長(zhǎng)約27 kb，含9個(gè)外顯子（exon 1、2a、2b、3-8），有2個(gè)高度同源拷貝SMN1和SMN2，端粒側(cè)稱(chēng)SMNT（telomeric SMN）或SMN1，著絲粒側(cè)稱(chēng)SMNC（centromeric SMN）或SMN2。兩者僅在各自的3′端有5個(gè)堿基的差別，其中2個(gè)堿基位于外顯子7、8，另3個(gè)堿基在內(nèi)含子6、7［7］。神經(jīng)元凋亡抑制基因（NAIP）基因編碼神經(jīng)元凋亡抑制蛋白，是SMA的修飾基因。

SMN1基因的缺失是SMA的基礎(chǔ)發(fā)病機(jī)制，SMN2基因和NAIP基因的異常則與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［8］。約95％SMA患者存在SMN1基因第7號(hào)外顯子的純合性缺失［9，10］。疾病嚴(yán)重程度與SMN2拷貝數(shù)相關(guān)，大部分Ⅰ型患者有2個(gè)拷貝數(shù)，Ⅱ型患者有3個(gè)拷貝數(shù)，Ⅲ型和Ⅳ型有3到4個(gè)拷貝數(shù)。NAIP基因的第5、6號(hào)外顯子可能與SMA的臨床表型有關(guān)。

SMN1編碼全長(zhǎng)的SMN轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（SMN-fl），而SMN2編碼生成大量跳躍外顯子7的選擇性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（SMN△7）和少量SMN-fl。SMN-fl編碼一個(gè)包涵294個(gè)氨基酸，分子量為38k D的蛋白，稱(chēng)為SMN蛋白。SMN蛋白廣泛分布于全身組織中，表達(dá)水平各異，其中腦、脊髓和肌肉中的表達(dá)水平最高。SMN基因缺失或突變時(shí)，其表達(dá)產(chǎn)物SMN蛋白數(shù)目、結(jié)構(gòu)、功能均異常。SMN蛋白數(shù)量低于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元所需最低含量時(shí)，將發(fā)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。因此，推測(cè)SMA的機(jī)制可能為SMN基因缺失或突變導(dǎo)致SMN蛋白數(shù)目、結(jié)構(gòu)或功能異常，引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，從而導(dǎo)致肌無(wú)力、肌萎縮。

3 診斷

3.1 臨床表現(xiàn) SMA的主要診斷依據(jù)是臨床表現(xiàn)，特別是癥狀嚴(yán)重的患兒。患兒一般無(wú)智力低下，肌力的下降通常為對(duì)稱(chēng)性的，近端重于遠(yuǎn)端，下肢重于上肢，疾病的嚴(yán)重程度與發(fā)病年齡相關(guān)。臨床上是否易被發(fā)現(xiàn)以及腱反射的消失與疾病的年齡背景相關(guān)。嚴(yán)重病例的臨床特點(diǎn)包括：哭聲或咳嗽無(wú)力，喂養(yǎng)困難，不能抬頭等。臨床上接診到與SMA臨床特點(diǎn)一致或相似的病人時(shí)，診療流程如圖1。

圖1 脊髓性肌萎縮的診斷流程圖

3.2 基因檢測(cè) 對(duì)懷疑SMA的患者進(jìn)行的第一層診斷性檢測(cè)為SMN1基因純合缺失的檢測(cè)。SMN1基因外顯子7缺失（伴或不伴外顯子8的缺失）可被診斷為SMA，敏感性95％，特異性100％［11］。在SMA患者中最常見(jiàn)的突變是SMN1基因的純合缺失，大部分?jǐn)y帶者可檢測(cè)到SMN1基因其中一個(gè)等位基因的缺失，對(duì)SMN1基因外顯子7、8進(jìn)行檢測(cè)，是SMA基因診斷和產(chǎn)前診斷的首選方法?；蛉笔У臋z測(cè)方法包括單肽鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（PCR-SSCP）、錯(cuò)配PCR-限制性片段多態(tài)性（PCR-RFLP）、等位基因特異性PCR（AS-PCR）、變性高效液相色譜（DHPLC）、多重依賴(lài)性探針擴(kuò)增法（MPLA）等。分子細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)敏感性為93％～95％，部分潛在SMA患者在出現(xiàn)典型臨床癥狀前可能無(wú)法檢出。

在眾多SMA的分子診斷技術(shù)中，PCR-RFLP最常用，也是最初用于確定SMA治病基因的基因檢測(cè)方法?？筛鶕?jù)SMN1和SMN2基因外顯子間堿基差別設(shè)計(jì)錯(cuò)配引物，并根據(jù)特異的酶切位點(diǎn)判定SMN1基因是否存在純合缺失。但該方法有一定局限性，無(wú)法檢出攜帶者的雜合缺失［12］。

MLPA是2002年荷蘭學(xué)者Schouten等發(fā)明的一項(xiàng)基因半定量分析技術(shù)，可對(duì)致病基因及修飾基因進(jìn)行定量分析。陳雅芳等［13］通過(guò)比較MLPA與PCR-RFLP兩種基因檢測(cè)方法，得出結(jié)論：MLPA是簡(jiǎn)便、高校、可靠的基因定量分析技術(shù)，在SMA的診斷、攜帶者篩查及產(chǎn)前診斷工作中是一種有效的基因檢測(cè)方法。

DHPLC是一種高通量、自動(dòng)化的基因檢測(cè)技術(shù)，已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用DHPLC與PCR-RFLP兩種方法同時(shí)檢測(cè)SMA患兒及正常對(duì)照血清，證實(shí)DHLPC省時(shí)、高靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法?？梢詼?zhǔn)確診斷出SMN基因的拷貝數(shù)，可作為患者及攜帶者篩查的檢測(cè)方法［14，15］。

3.3 輔助檢查 當(dāng)基因檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢查，包括肌酸激酶（creatine kinases，CK）、肌電圖（electromyography，EMG）和神經(jīng)傳導(dǎo)檢測(cè)。如果EMG檢測(cè)提示為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，則進(jìn)一步進(jìn)行SMN突變檢測(cè)。通過(guò)多重連接酶探針依賴(lài)擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）或?qū)崟r(shí)定量PCR方法可檢測(cè)SMN1基因拷貝數(shù)，這種半定量檢測(cè)方法可將敏感性提高到98％［16］。如果患者僅有1個(gè)SMN1拷貝，需對(duì)無(wú)缺失的等位基因進(jìn)行測(cè)序用以確定是否含有較少見(jiàn)的病因（突變），常見(jiàn)的基因微小變異包括：點(diǎn)突變、插入和缺失。然而，約有1/3的患者有典型的臨床表現(xiàn)和SMN1 1個(gè)拷貝，在SMN1/SMN2編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)其他突變。這一特征在SMAⅢ型患者中更常見(jiàn)，也許和更深層次的基因內(nèi)突變有關(guān)，目前尚未證實(shí)。

4 產(chǎn)前診斷

SMA是常見(jiàn)遺傳性疾病之一，攜帶者頻率約為1/50，缺乏有效的治療手段，攜帶者基因篩查并進(jìn)行必要的產(chǎn)前診斷是公認(rèn)的預(yù)防措施。對(duì)高危人群進(jìn)行詳盡的遺傳咨詢(xún)并進(jìn)行產(chǎn)前診斷，是降低SMA出生率的有效方法。Mahmoud等［17］指出對(duì)于SMN1基因雜合缺失突變攜帶的夫妻，SMN1基因缺失的分析產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確率接近100％。曾經(jīng)生育過(guò)SMA患兒的夫婦，SMA患兒的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為25％，在以后的每次妊娠期間均需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。可通過(guò)絨毛活檢術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)或臍靜脈穿刺術(shù)對(duì)胎兒進(jìn)行取樣，并對(duì)胎兒樣品進(jìn)行SMN基因檢測(cè)，對(duì)于確診的SMA胎兒，可通過(guò)知情同意擇時(shí)實(shí)施終止妊娠，避免其出生，以達(dá)到防治出生缺陷，提高人口素質(zhì)的目的。

劉新秀等［18］對(duì)17～20周有SMA生育史的孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，應(yīng)用PCR-RFLP方法檢測(cè)SMN1基因缺失情況，并用短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）進(jìn)行母血污染鑒定。黃歡等［19］自行研制“Hb H-Buffer”，對(duì)羊水直接擴(kuò)增，結(jié)果顯示，與提取羊水DNA后的擴(kuò)增效率一致。擴(kuò)增后通過(guò)PCR-RFLP方法進(jìn)行分析SMN基因缺失情況。應(yīng)用羊水細(xì)胞直接擴(kuò)增法，可減少樣本量，簡(jiǎn)化步驟，減少污染可能，并可實(shí)現(xiàn)快速產(chǎn)前診斷。在SMA的產(chǎn)前診斷中是一種值得推廣的技術(shù)。

植入前診斷（Preimplantation genetic diagnosis，PGD）是預(yù)防遺傳性疾病并可避免終止妊娠術(shù)的一種產(chǎn)前診斷方法。但用于PGD的單個(gè)二倍體細(xì)胞所能獲取到的DNA量有限，導(dǎo)致了包括檢出污染率增高、等位基因擴(kuò)增失敗等在內(nèi)的一系列問(wèn)題。STR具有可擴(kuò)增、高度多態(tài)性等特點(diǎn)，克服了這些限制。在此，文獻(xiàn)報(bào)道適于SMA檢測(cè)的側(cè)翼基因區(qū)的五個(gè)STR雜合性分析標(biāo)記（D5S1408，D5S1417，D5S610，D5S637）。這些STR位點(diǎn)符合Hardy溫伯格平衡?？蓪㈩?lèi)似方法用于其他單基因病的植入前診斷［20］。

2008年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics，ACMG）的指南［21］指出：目前，僅有SMA家族史陽(yáng)性的群體接受了相關(guān)基因攜帶的篩查，推薦應(yīng)用到更廣范圍的人群篩查。因其滿(mǎn)足進(jìn)行人群篩查的五大關(guān)鍵因素，即臨床表現(xiàn)嚴(yán)重、人群攜帶率高、有靈敏特異的可靠檢測(cè)方法、可進(jìn)行產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢(xún)等。國(guó)內(nèi)，有產(chǎn)前診斷資質(zhì)，有條件開(kāi)展SMA致病基因篩查及診斷的單位，如能進(jìn)行人群SMN基因篩查，針對(duì)雙方均為攜帶者的夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，避免SMA患兒的出生，能更有效降低SMA患兒出生率。從而達(dá)到降低出生缺陷、提高人口素質(zhì)的目的。

5 治療

由于SMA的病理生理學(xué)機(jī)制未明，目前暫無(wú)有效治療辦法。在過(guò)去的數(shù)十年間，SMA的治療以支持性護(hù)理措施為主，無(wú)有效治療方法。近年來(lái)，隨著SMA相關(guān)分子學(xué)機(jī)制研究的不斷深入，幾種治療方法在不斷發(fā)展完善，治療策略包括依賴(lài)SMN的治療和不依賴(lài)SMN的治療［22］。

5.1 依賴(lài)SMN的治療 依賴(lài)SMN的治療策略是通過(guò)藥物、RNA、反式剪接RNA、干細(xì)胞等，改善SMN2基因表達(dá)以及SMN蛋白含量，從而達(dá)到改善SMA癥狀的目的。

5.1.1 藥物治療 一種潛在的SMA治療模式是利用小分子物質(zhì)，增加外顯子7的插入、激活SMN2啟動(dòng)子、延長(zhǎng)SMN mRNA或SMN蛋白半衰期、延長(zhǎng)SMN蛋白的C端，或整合以上分子活動(dòng)。新型喹唑啉衍生物及組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑是最新開(kāi)發(fā)的新藥，前者尚在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段［23］，后者處于臨床研究階段［24］。

5.1.2 基于RNA的治療 利用小分子RNA對(duì)異常m RNA進(jìn)行間接重排，這是包括SMA在內(nèi)的常見(jiàn)遺傳性疾病的擴(kuò)展研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。調(diào)節(jié)SMN2m RNA可恢復(fù)適當(dāng)?shù)腟MN蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到改善SMA患者癥狀的目的。

本領(lǐng)域的研究主要圍繞反義寡核苷酸（ASOs）展開(kāi)，根據(jù)SMN2基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用ASOs拼接結(jié)合成雙功能RNA基團(tuán)［25-27］，在小鼠模型側(cè)腦室內(nèi)注射這些雙功能RNA基團(tuán)，可使鼠腦內(nèi)SMN蛋白含量增加［28］。由載體運(yùn)載的雙功能RNA基團(tuán)到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)后，小鼠腦和脊髓的SMN蛋白含量可與雜合突變基因攜帶者SMN蛋白含量相媲美［29］。

5.1.3 反式剪接RNA SMN反式剪接是RNA治療外的一種很有前景的治療方法。反式-拼接需要組成的3個(gè)域的合成RNA（tsRNA）：①域名綁定進(jìn)行交互與特定的目標(biāo)；②拼接的域進(jìn)行剪接反應(yīng)與所選的內(nèi)含子；③完整外顯子或一系列的外顯子以更換有缺陷的基因片段。反式-拼接的產(chǎn)品是嵌合mRNA，轉(zhuǎn)化為有功能的蛋白質(zhì)。向嚴(yán)重的SMA小鼠體內(nèi)注射tsRNA后明顯改善疾病嚴(yán)重程度并延長(zhǎng)壽命70％［30］。

5.1.4 干細(xì)胞 近年來(lái)備受關(guān)注的SMA治療策略是用干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療。細(xì)胞替代是通過(guò)移植經(jīng)過(guò)體外或內(nèi)源性干細(xì)胞激活的中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。目前干細(xì)胞治療僅有骨髓移植和間充質(zhì)細(xì)胞移植，尚無(wú)應(yīng)用于SMA的研究報(bào)道。脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞可改善SMA鼠模型的表型，但僅限于基礎(chǔ)研究，尚無(wú)法推廣到人［31］。在另一項(xiàng)研究中，對(duì)較嚴(yán)重的SMA鼠模型注射胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞前體，源于多能干細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞表現(xiàn)出治療潛能［32］。近來(lái)，從病人的成纖維細(xì)胞中成功誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞（iPS），是研究用于干細(xì)胞治療的基因兼容神經(jīng)元的一個(gè)重大進(jìn)步。

5.2 不依賴(lài)SMN的治療

5.2.2 肌肉增強(qiáng) 肌肉增強(qiáng)被認(rèn)為是SMA治療的目標(biāo)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，人血清白蛋白基因啟動(dòng)子可控制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肌肉中SMN的表達(dá)，肌肉中表達(dá)的SMN獨(dú)立于骨骼肌之外，與SMA分型不沖突?？赡軝C(jī)制是增強(qiáng)的肌肉有助于內(nèi)在運(yùn)動(dòng)單位的維持和穩(wěn)定［33］。兩個(gè)研究比較了各種肌肉生長(zhǎng)抑制劑的抑制素通路，其中一個(gè)研究證明重組卵泡休止素釋放后，壽命和運(yùn)動(dòng)功能可有中等程度改善；另一個(gè)研究，檢測(cè)到Act RIIB-Fc或重組卵泡休止素治療后的SMNΔ7小鼠，表型未改變［34，35］。存在這種差異的基礎(chǔ)尚不清楚，可能是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元需要額外的支持，以最佳方式響應(yīng)基于SMN的治療。

5.2.3 肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué) 有學(xué)者使用一種稱(chēng)為Smn2B的新型溫和SMA鼠模型進(jìn)行研究，經(jīng)Rho激酶抑制劑治療后，生存時(shí)間急劇增加，神經(jīng)肌肉接頭也被增強(qiáng)，并在后來(lái)的治療中更成熟。值得注意的是，這些表型的改變與SMN的增加無(wú)關(guān)。這些研究結(jié)果不僅提供新的治療靶點(diǎn)，還可能豐富SMN功能的視野。

6 展望

脊髓性肌萎縮是一種常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，目前暫無(wú)有效治療方法，嚴(yán)重類(lèi)型起病急危害重，做好疾病的診斷與產(chǎn)前診斷，盡量避免更多患者的出現(xiàn)是預(yù)防SMA的有效方法。如能對(duì)人群展開(kāi)篩查，對(duì)攜帶者夫妻進(jìn)行遺傳咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷，則更能有效地降低脊髓性肌萎縮的發(fā)病率。研究出有效治療方法，也是SMA研究的一個(gè)重要方向。

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編輯：宋文穎

R714.55.1

A

10.13470/j.cnki.cjpd.2014.03.015

2014-05-26）