彭園園 張艷華 趙麗娟 高虹

（石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，河北石家莊 050011）

孕婦血漿游離胎兒DNA檢測在產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用

彭園園*張艷華 趙麗娟 高虹

（石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，河北石家莊 050011）

目的探討無創(chuàng)性染色體非整倍體檢測技術(shù)在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。方法采用高通量基因測序技術(shù)對1680例孕婦進(jìn)行母體血漿游離胎兒DNA檢測，分析胎兒染色體拷貝數(shù)。結(jié)果異常者進(jìn)一步行羊水或臍血穿刺染色體核型分析以確診。結(jié)果1680例孕婦中共報(bào)告異常19例，包括21三體10例，18三體3例，性染色體非整倍體6例。經(jīng)羊水或臍血染色體核型分析，檢出的10例21三體中1例為假陽性，6例性染色體異常中1例為假陽性。游離胎兒DNA高通量基因測序技術(shù)的敏感度為100％（17/17），特異度為99.88％（1661/1663），陽性預(yù)測值為89.47％（17/19），陰性預(yù)測值為100％（1661/1661）。結(jié)論利用高通量基因組測序技術(shù)檢測孕婦血漿游離胎兒DNA行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體，具有無創(chuàng)、快速、敏感特異等優(yōu)勢，具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

非整倍體；游離胎兒DNA；無創(chuàng)產(chǎn)前檢測

我國是出生缺陷的高發(fā)國。據(jù)2012年中國出生缺陷防治報(bào)告顯示，目前我國出生缺陷率約為5.6％，每年新增出生缺陷兒約90萬例。目前臨床二級(jí)預(yù)防出生缺陷的主要方法是血清學(xué)篩查高危后進(jìn)行羊水穿刺等有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。但由于血清學(xué)篩查是通過孕婦血清標(biāo)志物水平間接反應(yīng)胎兒的情況，存在約5％的假陽性率，增加了不必要的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，且檢出率較低，存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。而羊水穿刺等侵入性操作亦存在一定的流產(chǎn)率，在實(shí)際應(yīng)用中給孕婦及其家屬帶來了極大的精神心理負(fù)擔(dān)。因此，臨床上急需一種更安全、高效、準(zhǔn)確的非侵入性檢測方法，以提高現(xiàn)有產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的效率和質(zhì)量。

隨著1997年香港中文大學(xué)的盧煜明教授等［1］首次發(fā)現(xiàn)母體外周血中存在游離胎兒DNA以及基因測序等技術(shù)的快速發(fā)展，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal test，NIPT）技術(shù)越來越受到臨床的重視。本研究中我們采用高通量基因組測序技術(shù)檢測孕婦血漿游離胎兒DNA，以評(píng)估NIPT技術(shù)的準(zhǔn)確性和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年1月至2013年11月，共收集因高齡、產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、超聲顯示胎兒異常等同意進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的孕婦1680例，均為單胎，且無其他不適宜進(jìn)行該檢測的情況。孕婦年齡19～47歲，平均29.78歲，孕齡為12～36周，平均20.56周。孕婦臨床資料詳見表1。

1.2 方法 經(jīng)知情同意后抽取外周靜脈血5 ml。由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA提取、文庫制備以及并行基因組測序。測試樣本的21號(hào)染色體T值≥3即判定胎兒為21三體高風(fēng)險(xiǎn)，18號(hào)染色體T值≥3即判定胎兒為18三體高風(fēng)險(xiǎn)。對檢測結(jié)果陽性者進(jìn)行羊水或臍血穿刺及染色體核型分析，對檢測結(jié)果陰性者行電話隨訪其胎兒出生后情況。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

所有孕婦均成功完成游離胎兒DNA檢測，檢測結(jié)果為陽性者共19例，包括21三體10例、18三體3例、性染色體非整倍體6例（表2）。高齡組孕婦的異常檢出率為2.49％（8/321），顯著高于低齡組孕婦的0.81％（11/1359）。未發(fā)現(xiàn)不同孕周患者的異常檢出率存在顯著性差異。

表2 1680例孕婦血漿游離胎兒DNA檢測異常情況［n（％）］

游離胎兒DNA檢測結(jié)果異常的19例孕婦均進(jìn)行了羊水穿刺或臍血穿刺及染色體核型分析。結(jié)果顯示，1例21三體高風(fēng)險(xiǎn)者為假陽性，1例性染色體非整倍體者為假陽性，兩者的染色體核型均正常。截至發(fā)稿，對游離DNA檢測結(jié)果陰性孕婦經(jīng)隨訪新生兒出生情況，未訴明顯異常。游離胎兒DNA檢測對21三體檢測的靈敏度為100％（9/9），特異度為99.94％（1670/1671），陽性預(yù)測值為90％（9/10），陰性預(yù)測值為100％（1670/1670）；對18三體檢測的靈敏度為100％（3/3），特異度為100％（1677/1677），陽性預(yù)測值為100％（3/3），陰性預(yù)測值為100％（1677/1677）；對性染色體非整倍體檢測的靈敏度為100％（5/5），特異度為99.94％（1674/1675），陽性預(yù)測值為83.33％（5/6），陰性預(yù)測值為100％（1674/1674）。因此，游離胎兒DNA高通量基因測序技術(shù)的敏感度為100％（17/17），特異度為99.88％（1661/1663），陽性預(yù)測值為89.47％（17/19），陰性預(yù)測值為100％（1661/1661）。

3 討論

Bianchi等［2］的研究顯示NIPT對21三體、18三體、13三體的檢測靈敏度分別為100％、97.2％和78.6％，特異性均為100％。國內(nèi)Dan等［3］的研究顯示，NIPT針對21、18三體的檢測靈敏度為100％，特異度為99.96％。何小玲等［4］對胎兒游離DNA用于產(chǎn)前檢測染色體非整倍體準(zhǔn)確性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)顯示，NIPT對21三體的檢測靈敏度為100％，特異性為99.3％；對18三體的檢測靈敏度為97.4％，特異性為99.95％。本研究顯示，NIPT對21、18三體及性染色體非整倍體的檢測敏感度均為100％，特異度均達(dá)99.9％以上，與國內(nèi)外報(bào)道一致。研究中有1例21三體和1例性染色體非整倍體為假陽性。母體血漿中胎兒DNA含量是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素之一。游離胎兒DNA主要來源于胎盤組織，其在母體血漿中的含量可能與胎盤屏障功能關(guān)系密切［5］。如果存在胎盤鈣化、胎盤發(fā)育不良、胎盤破損等胎盤屏障功能障礙，很可能會(huì)導(dǎo)致母體血漿中的游離胎兒DNA含量下降而影響檢測結(jié)果。

目前產(chǎn)前篩查體系存在較高的假陽性率。除了對高危低齡孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷外，還需對日益增加的高齡孕婦進(jìn)行產(chǎn)前細(xì)胞遺傳學(xué)診斷，但現(xiàn)有醫(yī)療資源無法滿足不斷增多的產(chǎn)前診斷需要。國內(nèi)外研究報(bào)道，對高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的大規(guī)模血漿游離胎兒DNA高通量基因測序分析可以避免98％～99％的有創(chuàng)操作［6，7］。本研究通過2年的實(shí)際應(yīng)用，可以看到對血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦（739例）先進(jìn)行無創(chuàng)DNA檢測，然后再進(jìn)行羊水或臍血細(xì)胞培養(yǎng)和核型分析（11例），可使98.5％的孕婦避免不必要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，極大地降低了孕婦的心理壓力，也緩解了臨床資源緊張的壓力。

2012年國際產(chǎn)前診斷學(xué)會(huì)發(fā)表聲明指出，通過篩查、年齡或家族史確定為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，可以進(jìn)行NIPT檢測［8］。美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)與美國母胎醫(yī)學(xué)會(huì)也共同發(fā)表委員會(huì)指導(dǎo)意見，推薦NIPT作為非整倍體高危人群的初篩檢測［9］。2013年1月美國國家遺傳咨詢師協(xié)會(huì)的指導(dǎo)意見認(rèn)為［10］，NIPT當(dāng)前只作為產(chǎn)前染色體非整倍體評(píng)估的補(bǔ)充檢測，其結(jié)果不能視為診斷，異常結(jié)果必須通過細(xì)胞遺傳學(xué)診斷確診。此外，由于缺乏在中低風(fēng)險(xiǎn)人群中的臨床數(shù)據(jù)，NIPT暫時(shí)不能替代現(xiàn)有的染色體非整倍體篩查方法。2012年我國產(chǎn)前診斷技術(shù)專家組指出［11］，NIPT檢測技術(shù)是一種“近似于診斷水平”、“目標(biāo)疾病指向精確”的產(chǎn)前篩查新技術(shù)，應(yīng)該與現(xiàn)行的產(chǎn)前篩查體系相結(jié)合，并準(zhǔn)確把握臨床適用人群。

NIPT檢測胎兒染色體非整倍體具有以下優(yōu)點(diǎn)：①安全無創(chuàng)，無流產(chǎn)及感染風(fēng)險(xiǎn)；②敏感性和特異性均高達(dá)99％以上；③孕12周以上均可進(jìn)行檢測，克服了傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)在取材及檢測時(shí)間等方面的缺陷和限制；④檢測周期短；⑤極低的假陽性率可大幅降低侵入性產(chǎn)前診斷比例。但是該技術(shù)也存在著一定的局限性：①不適用于本身為染色體病或攜帶者的孕婦和雙胎孕婦；②僅針對21三體、18三體和13三體，無法檢測染色體結(jié)構(gòu)異常；③血漿中游離胎兒DNA濃度較低時(shí)，檢測的特異性和敏感性較差；④檢測費(fèi)用過高；⑤此技術(shù)目前仍定位為篩查實(shí)驗(yàn)，當(dāng)出現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果時(shí)需通過有創(chuàng)性診斷以確診。

本研究為回顧性總結(jié)分析，不足之處在于未對大樣本的孕婦同時(shí)開展NIPT檢測、傳統(tǒng)唐篩、羊水/臍血穿刺-核型分析3種方法之間的比較，缺乏假陰性率的評(píng)價(jià)，未能對NIPT技術(shù)的準(zhǔn)確性做出完整的評(píng)估。

綜上所述，隨著科學(xué)研究的不斷深入，檢測樣本量的增加，信息分析方法的不斷優(yōu)化以及未來臨床規(guī)范的制定，相信NIPT技術(shù)應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體檢測的局限性將越來越小，檢測準(zhǔn)確率將越來越高，從而切實(shí)有效的推動(dòng)我國的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷工作。

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編輯：孟夢

ObjectiveTo investigate the value of noninvasive chromosome aneuploidy detection technology.MethodHigh-flux sequencing was applied to analyze fetal chromosome sequence copy numbers in 1680 pregnant women.Fetal karyotyping was carried out on positive samples by amnioeentesis or cordocentesis.ResultsNineteen cases were detected with fetal chromosomal abnormalities by high-flux sequencing analysis，including 10 cases of trisomy 21，3 cases of trisomy 18，6 cases of sex chromosome aneuploidy.One case of trisomy 21 and one case of sex chromosome abnormalities were false positive identified by karyotyping.trisomy）.The sensitivity and specificity of high-flux sequencing were 100％（17/17）and 99.88％（1661/1663），respectively.The positive predictive value was 89.47％（17/19），and negative predictive value of 100％（1661/1661）.ConclusionsHigh-fluxsequencing analysis of free DNA derived from maternal plasma is noninvasive，rapid and highly sensitive and specific for detecting fetal chromosomal aneuploidies，which therefore has a broad clinically practical value.

aneuploidy；free fetal DNA；noninvasive prenatal test

R714.53

A

10.13470/j.cnki.cjpd.2014.03.012

2014-04-11）

*通訊作者：彭園園，Email：pyyduck＠163.com