李海濱，胡曉旭，普 開，譚 偉，楊 敏，王紅斌，*

（1.云南民族大學，民族藥資源化學國家民委，教育部重點實驗室，云南昆明650500；2.云南民族大學校醫(yī)院，云南昆明650500；3.大理市農產品質量安全檢測站，云南大理671000；4.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650500）

響應面法優(yōu)化野波羅蜜根皮總黃酮的微波提取工藝

李海濱1，2，胡曉旭1，3，普 開1，4，譚 偉1，4，楊 敏1，4，王紅斌1，4，*

（1.云南民族大學，民族藥資源化學國家民委，教育部重點實驗室，云南昆明650500；2.云南民族大學校醫(yī)院，云南昆明650500；3.大理市農產品質量安全檢測站，云南大理671000；4.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650500）

目的：運用響應面分析法優(yōu)化野波羅蜜根皮總黃酮的微波提取工藝。方法：以野波羅蜜根皮為材料，采用微波提取法，提取野波羅蜜根皮總黃酮。在單因素實驗的基礎上，利用Box-Benhnken中心組合實驗和響應面分析法，優(yōu)選微波法提取野波羅蜜根皮總黃酮的工藝條件。結果：野波羅蜜根皮總黃酮的最佳提取工藝為：在60%的乙醇溶液中微波提取，液固比為52∶1mL/g，微波時間為2.2min；此條件下，野波羅蜜根皮總黃酮實際提取率為9.82%，預測值為9.80%。結論：運用響應面分析法優(yōu)化得到的微波提取參數(shù)準確、可靠。

野波羅蜜根皮，總黃酮，微波提取，響應面分析

波羅蜜屬（Artocarpus）是?？浦参镏幸粋€重要的屬，全世界有50多種，廣泛分布于東南亞的熱帶地區(qū)[1]。我國約有15種，分布于南方各省[2]。近幾年來發(fā)現(xiàn)波羅蜜屬植物含多類黃酮類化合物[3]，包括黃酮類、查耳酮類和二氫黃酮類等，具有抗炎、抗氧化及抗病毒等多種生物活性[4-6]，值得進一步研究和開發(fā)。

常用的黃酮類化合物的提取方法有：水提法、有機溶劑提取法[7]、微波法[8]、超聲波法、酶解法、超濾法、超臨界流體萃取法等[9]。其中單一使用水提或有機溶劑提取法，提取率較低；超聲法與微波法相比，耗時較長，且對人體健康傷害較大；酶解法、超濾法、超臨界流體萃取法等的提取成本較高，不利于大規(guī)模生產應用。綜上所述，微波提取法不但能夠提高黃酮類化合物的提取率，還能大大縮短提取時間，且成本較低。

本實驗以波羅蜜屬中的野波羅蜜根皮為研究對象，采用微波法提取野波羅蜜根皮中的總黃酮，在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析法[10-12]對野波羅蜜根皮總黃酮的提取工藝條件進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野波羅蜜根皮 采集于云南省普洱市孟連縣，經云南省植物研究所鑒定，干燥后，用粉碎機粉碎，過80目篩備用；蘆丁標準品（≥95.0%） 貴州迪達科技有限責任公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等其他試劑 均為國產分析純；蒸餾水。

PJ17F-F（Q）型美的小康星微波爐 美的微波爐電器有限公司；WFJ7200型可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；OSB-2100型旋轉蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野波羅蜜根皮總黃酮的提取[13]準確稱取一定質量的野波羅蜜根皮粉于小燒杯中，按一定的液固比加入乙醇水溶液，放入微波爐進行提取，微波一定時間后，收集提取液，過濾，并旋蒸（至幾乎不含乙醇），加蒸餾水稀釋，過D101大孔吸附樹脂柱（徑高比為1∶10），先用蒸餾水過柱去除糖類色素，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，定容，作為待測液備用。

以蘆丁為對照品，硝酸鋁為顯色劑，使用分光光度計，在510nm處對待測液進行比色測定[14]?；貧w方程：A=9.8393C+0.0021，（其中A為待測液的吸光度，C為待測液中總黃酮的濃度），相關系數(shù)r=0.9998。

1.2.2 總黃酮提取的單因素實驗 當液固比為40∶1，提取時間為2min，以不同的乙醇濃度（30%、50%、60%、70%、90%）進行單因素實驗；當乙醇濃度為50%，提取時間為2min，變化液固比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1mL/g）進行單因素實驗比較；當固定乙醇濃度為50%，液固比為60∶1，變化提取時間（1、2、3、4、5min）分別進行單因素實驗，考察各因素對野波羅蜜根皮總黃酮提取率的影響。其中，總黃酮提取率計算公式如下：

式中：W—總黃酮提取率（%）；C—根據回歸方程計算的總黃酮濃度值（mg/mL）；V1—測定時的體積（mL）；V2—樣液定容后的體積（mL）；V3—測定時的取樣量（mL）；N—稀釋倍數(shù)；M—野波羅蜜根皮粉干重（g）。

1.2.3 野波羅蜜根皮總黃酮提取工藝的響應面優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，以乙醇濃度（A）、液固比（B）、提取時間（C）為Box-Behnken設計的自變量，以野波羅蜜根皮總黃酮的提取率為響應值，進行響應面實驗設計，優(yōu)化總黃酮提取工藝。通過Design Expert軟件對實驗數(shù)據進行回歸分析，預測總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。因素水平表見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table.1 Response surface analysis of factors and levels

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果及分析

分別改變乙醇濃度、液固比、提取時間，按照上述條件提取野波羅蜜根皮總黃酮，測定其吸光度，并計算提取率（Y）。得到乙醇濃度、液固比、提取時間3個因素對總黃酮提取率的影響見圖1～圖3。

2.1.1 乙醇濃度的單因素實驗 由圖1可知，當乙醇濃度為60%時，野波羅蜜根皮總黃酮的提取率最高，當?shù)陀诨蚴浅^60%時，總黃酮提取率明顯下降。根據“相似相溶”原理，總黃酮的溶出與溶劑的極性和本身的極性相關，極性相似可達到最大溶出率。所以，本實驗選擇60%乙醇作為野波羅蜜根皮總黃酮的提取溶劑。

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.1.2 液固比的單因素實驗 由圖2可知，隨著液固比的增加，總黃酮的提取率呈現(xiàn)先增大后減小現(xiàn)象，在50∶1處達到最大。雖然，增大液固比能夠加快傳質過程，但是，溶劑增加的同時也增加了微波加熱的負荷，相同時間內，總黃酮提取率反而下降。因此，液固比選擇50∶1較佳。

2.1.3 提取時間的單因素實驗 由圖3可知，提取時間為2min時，提取率最高，當?shù)陀诨蚋哂?min時，總黃酮的提取效果均不理想。微波在短時間內對溶質的傳質作用影響比較大，但超過一定時間后，由于溫度過高，溶劑揮發(fā)過快，提取物中的黃酮類化合物結構受到破壞，使得野波羅蜜根皮總黃酮的提取率下降。

圖2 液固比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave heating time on extraction yield of total flavonoids

2.2 響應面實驗結果

根據中心組合設計原理，以乙醇濃度、液固比和提取時間3個因素為自變量，野波羅蜜根皮總黃酮提取率為響應值，實驗設計與實驗結果見表2（其中17個處理中，1～12是析因實驗；13～17是中心實驗）。

表2 響應面實驗設計及實驗結果Table.2 Response surface design and test results of flavonoid extraction

以野波羅蜜根皮總黃酮的提取率為響應值，對各因素進行回歸擬合，得到響應值Y與各因子間的回歸方程如下：

Y=9.74-0.28A+0.20B+0.38C-0.023AB+0.16AC-7.500E-003BC-2.28A2-0.62B2-1.08C2

響應面二次模型的提取回歸方差分析的結果見表3。該方程p＜0.0001，失擬項p=0.0538＞0.05，不顯著，因此該模型是極顯著的。相關系數(shù)r=0.9972，說明響應值（總黃酮提取率）的變化有99.72%來源于所選變量，即乙醇濃度、液固比和提取時間。所以，該模型可用來預測微波法提取野波羅蜜根皮總黃酮的各個影響因素對總黃酮提取率的最佳提取工藝條件。

其中，線性項中，乙醇濃度和提取時間的p值都小于0.01，表明其對總黃酮提取率的影響極顯著；但對于液固比的p值，0.01＜p＜0.05，表明其影響顯著。所有交互項的p值均大于0.05，說明其交互作用均不顯著。而所有的二次項（p＜0.01）對模型具有極度顯著性。

2.3 響應面分析

保持3個變量中的1個不變，得到乙醇濃度、液固比和提取時間各因素之間兩兩相互關系對微波法提取野波羅蜜根皮總黃酮提取率影響的三維響應面曲線。響應面結果見圖4～圖6。

其中，圖4固定提取時間為2min；圖5固定液固比為50∶1（mL/g）；圖6固定乙醇濃度為60%。

比較以上三組響應面曲線圖可知，各因素中乙醇濃度和提取時間對野波羅蜜根皮總黃酮的提取率影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡；而液固比的影響則不太顯著，表現(xiàn)為曲面較平滑。

再由圖4曲面下的等高線可知，當乙醇濃度向峰值移動，等高線密度高于沿液固比向其峰值移動；從圖5可看出，乙醇濃度和提取時間兩因素向峰值移動，它們對響應值的影響相近；由圖6可得，沿液固比向峰值移動，等高線密度明顯高于沿提取時間因素移動。由圖中等高線密度的變化可知，乙醇濃度與提取時間比液固比對野波羅蜜根皮總黃酮提取率的影響大得多，這與響應面曲線的分析結果是一致的。

圖4 乙醇濃度和液固比對野波羅蜜根皮總黃酮提取率影響的響應面曲線圖Fig.4 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and solid-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

表3 提取回歸方差分析結果Table.3 Variance analysis of the developed regression equation for the yield of flavonoids

圖5 乙醇濃度和提取時間對野波羅蜜根皮總黃酮提取率影響的響應面曲線圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and microwave heating time on extraction yield of total flavonoids

圖6 液固比和提取時間對野波羅蜜根皮總黃酮提取率影響的響應面曲線圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of solid-to-liquid ratio and microwave heating time on extraction yield of total flavonoids

2.4 條件優(yōu)化、預測及驗證實驗

Design Expert軟件為響應面分析提供了最佳條件化優(yōu)化模塊，由軟件分析得到最佳提取工藝條件為：乙醇濃度58.35%，液固比51.57∶1mL/g，提取時間2.17min時，野波羅蜜根皮總黃酮的提取率最高，預測值為9.80%。

考慮到實際操作的局限性，各因素調整為：乙醇濃度60%，液固比52∶1（mL/g），提取時間2.2min。在此條件下進行驗證實驗，結果野波羅蜜根皮總黃酮的平均提取率為9.82%（n=3），與預測值接近，驗證了模型能較好的預測實際提取率。

3 結論

采用微波法對野波羅蜜根皮總黃酮進行提取，通過單因素實驗、Box-Behnken實驗設計以及響應面分析對微波提取工藝進行優(yōu)化，得出優(yōu)化的工藝條件為：乙醇濃度60%，液固比52∶1mL/g，提取時間2.2min。在優(yōu)化的提取條件下，總黃酮的提取率可達到9.82%，與預測值接近。因此，運用響應面分析法優(yōu)化得到的微波提取參數(shù)準確、可靠，具有實用價值。

[1]王永紅.兩種桑科藥用植物生物活性成分的研究[D].上海：復旦大學，2004.

[2]朱國福，楊延龍，侯愛君，等.波羅蜜屬藥用植物化合物SMMC-7721、SGC-7901細胞增殖及Caspase-3酶活性的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2007，27（5）：24-27.

[3]陳凱峰，歐陽勝，溫慧玲，等.波羅蜜屬植物2004-2008年新發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物及其生物活性研究概況[J].江西中醫(yī)藥，2009，40（5）：71-72.

[4]Masika P J，Sultanan N，Afolayan A J.Antibaeterial activity of two flavonoids isolated from schotia latifolia[J].Pharmaceutical Biology，2004，42（2）：105-109.

[5]Yong P H，Chuly C，Young C C，et al.Protective Effects of Puerarin on Carbon Tetrachloride-Induced Hepatotoxicity[J]. Arch Pharm Res，2007，30（10）：1309.

[6]Cheng J Y，Kondo K，Suzukiy，et al.Inhibitory effects of total flavones of Hippophae rhamnoidesL on thrombosis inmouse femoral artery and in vitro plateletag gregation[J].Life Science，2007，72：2263-2271.

[7]吳亞瓊.柑橘皮黃酮提取、純化和抗氧化性研究[D].楊凌：西北農業(yè)科技大學，2008.

[8]Chen L，Jin H，Ding L，et al.Dynamicmicrowave assisted extraction of flavonoids from Herba Epimedii[J].Separation and Purification Technology，2008，59：50-57.

[9]Khajeh M.Optimization of microwave-assisted extraction procedure for zinc and copper determination in food samples by Box-behnken design[J].Journal of Food Composition and Analysis， 2009，22（4）：343-346.

[10]Benavides A，Bassarello C.Flavonoids and isoflavonoids from Gynerium sagittatu[J].Phytochemistry，2007，68（9）：1277-1284.

[11]楊林，邵文斌，于愛紅，等.響應面法優(yōu)化蜆殼花椒果皮多糖提取工藝[J].中成藥，2012，34（9）：1806-1810.

[12]周國儀，舒靜，黃澤元.響應面法優(yōu)化超聲提取芝麻葉黃酮的研究[J].食品與機械，2007，23（3）：77-80.

[13]易軍鵬，朱文學，馬海樂，等.響應面法優(yōu)化微波提取牡丹籽油的工藝研究[J].食品科學，2009，30（14）：99-104.

[14]張靜，余加進，戴建輝，等.中藥提取物中總黃酮的分析研究[J].云南民族大學學報：自然科學版，2010，19（6）：414-416.

Optimization of microwave extraction of flavonoids from wild Jackfruit root barks by response surface methodology

LI Hai-bin1，2，HU Xiao-xu1，3，PU Kai1，4，TAN Wei1，4，YANG Min1，4，WANG Hong-bin1，4，*
（1.State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education Chemistry of Folk Medicine Resource Key Laboratory，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China；2.School Hospital，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China；3.Agricultural Products Quality and Safety Inspection Station of Dali，Dali 671000，China；4.College of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China）

Objective：These optimum conditions for the microwave extraction of flavonoids from wild jackfruit root barks were determined using response surface methodology.Methods：Wild jackfruit root barks as the materials，flavonoids were extracted by microwave extraction method.On the basis of one-factor-at-a-time experiments，the process conditions of microwave extraction of flavonoids from wild jackfruit root barks were optimized by Box-Benhnken central composite test and response surface analysis method.Results：Results showed that these optimal extraction conditions were as follows：60%ethanol solution as extraction solvent，microwave extraction time of 2.2min，liquid-to-solid ratio of 52∶1mL/g.Under these conditions，the actual extraction rate of flavonoids from wild jackfruit root barks total was 9.82%in comparison with the predicted yield of 9.80%.Conclusion：The parameter of microwave extraction was optimized by response surface methodology are accurate and reliable.

wild Jackfruit root barks；total flavonoids；microwave extraction；response surface analysis

TS201.1

B

1002-0306（2014）06-0226-05

2013－04－23 *通訊聯(lián)系人

李海濱（1968-），男，大學本科，副主任醫(yī)師，研究方向：臨床藥理作用與應用。

民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室開放基金項目（MZY1122）；云南省應用基礎研究計劃項目（2009CD100）；云南民族大學綠色化學與功能材料研究省創(chuàng)新團隊項目（2011HC008）；云南省高校綠色化學新能源與材料科技創(chuàng)新團隊項目（2011UY09）；云南民族大學化生學院大學生創(chuàng)新性實驗項目（2011HXZ01）；云南民族大學化生學院2011年大學生（碩士組）創(chuàng)新性實驗項目（11HXYJSZ1）。