李素麗 周 芳 張慶瑜△ 賈文亮 張安玲 韓 磊 康春生

microRNA（miRNA）是長(zhǎng)約22 nt的短鏈RNA，可與miRNA反應(yīng)元件（miRNA response elements，MREs）互補(bǔ)結(jié)合，結(jié)合后能夠通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的降解和（或）抑制其翻譯而負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)。人們對(duì)miRNA-mRNA已有足夠的認(rèn)識(shí)，但關(guān)于mRNA-miRNA反向作用卻知之甚少。已證實(shí)MREs能夠作用于miRNAs，從而調(diào)節(jié)后者的作用[1-2]。Tay等[3]證實(shí)腫瘤抑制因子PTEN假基因（PTENP1）的3′非翻譯區(qū)（UTR）能與PTEN結(jié)合相同的miRNA，以miRNA依賴的方式調(diào)控細(xì)胞PTEN和P-Akt蛋白水平。miR-200a/b/c在胃癌中低表達(dá)，通過(guò)抑制E盒結(jié)合鋅指蛋白（ZEB）的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。因此，本研究應(yīng)用人工合成ZEB2 3′UTR轉(zhuǎn)染人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，研究其對(duì)miR-200家族的調(diào)節(jié)作用，觀察并分析其對(duì)GES-1的影響，旨在從其增殖、遷移、侵襲力方面探討ZEB2 3′UTR導(dǎo)致正常胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ZEB2 3′UTR質(zhì)粒由南京金斯瑞公司合成；QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司,Trizol試劑及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，ZEB1、ZEB2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2/9、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及相應(yīng)二抗均購(gòu)自中杉金橋公司；dNTP mixture、反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）、RNase抑制劑購(gòu)自大連Takara公司，逆轉(zhuǎn)錄引物及qRT-PCR引物、熒光定量miRNA PCR試劑盒、miR-200b micmics購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司；GES-1由天津醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)腫瘤研究所饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建與提取 利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索ZEB2基因序列（Gen Bank,NM_001171653.1,NM_014795.3）找出其3′UTR含miR-200家族的結(jié)合序列全長(zhǎng)，選用PGL3-Control表達(dá)載體。將序列交由南京金斯瑞公司合成，見(jiàn)圖1。根據(jù)QIAGEN質(zhì)粒中提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒的提取與純化。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 GES-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于含5%CO2，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第一部分：檢測(cè)ZEB2 3′UTR轉(zhuǎn)染后對(duì)ZEB1/ZEB2 mRNA、蛋白水平及miR-200a/b/c的影響；實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、突變組和ZEB2 3′UTR組。第二部分：驗(yàn)證miR-200b在ZEB2 3′UTR轉(zhuǎn)染后調(diào)節(jié)增殖、侵襲、遷移中的作用；實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ZEB2 3′UTR組、ZEB2 3′UTR+無(wú)義序列組、ZEB2 3′UTR組+miR-200b micmics組。根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)處理細(xì)胞48 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-200a/b/c及ZEB1/ZEB2的表達(dá)變化 Trizol法提取待測(cè)細(xì)胞總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)應(yīng)用ZEB1、ZEB2、miR-200a/b/c特異性逆轉(zhuǎn)錄、PCR引物及相應(yīng)組分配置反應(yīng)體系。microRNA逆轉(zhuǎn)錄條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃10 min。所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA行qRTPCR檢測(cè)各組miR-200a/b/c的表達(dá)水平，反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，65℃30 s，72℃30 s；共40個(gè)循環(huán)。ZEB1、ZEB2 cDNA模板合成條件：42℃1 h。PCR擴(kuò)增，其特異性引物序列，見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件：94℃12 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。分別以U6、GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果判定采用2－ΔΔCT法。

Figure 1 Schematic representation of the ZEB2 3′UTR plasmid constructs圖1 ZEB2 3′UTRs區(qū)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

Table 1 The qRT-PCR primers sequences of ZEB1/ZEB2/GAPDH表1ZEB1、ZEB2、GAPDH qRT-PCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 用細(xì)胞裂解液RIPA裂解提取待測(cè)細(xì)胞的總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓80 V電轉(zhuǎn)移至PVDF印跡膜。膜封閉液封閉1 h后，加入一抗ZEB1、ZEB2、MMP2/9、PCNA、GAPDH（1∶1 000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。GAPDH蛋白作為內(nèi)參。以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/同一樣本內(nèi)參條帶灰度值計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 在Transwell上室聚碳酸酯濾膜（孔徑8 μm）上加入預(yù)冷無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質(zhì)膠（Matrigel∶DMEM=1∶2）100 μL，37℃30 min后待其凝固，接種100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋GES-1細(xì)胞（1×106個(gè)/mL），下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去上室液體，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，蘇木精染色。DP-70熒光相差倒置顯微鏡（×100）采集圖像，隨機(jī)讀取3個(gè)視野，計(jì)算穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。次日用200 μL微量移液槍頭在6孔板內(nèi)垂直及平行劃痕，PBS液洗滌2次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察0、48 h后劃痕兩側(cè)細(xì)胞的遷移情況并拍照。距離差除以2為細(xì)胞相對(duì)遷移距離，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)遷移率（相對(duì)遷移率=相對(duì)遷移距離/0 h時(shí)劃痕邊緣距劃痕中線距離），重復(fù)3次并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞以4×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染。取3組細(xì)胞測(cè)其吸光度（A）值，每組3個(gè)復(fù)孔，每24 h測(cè)1次。測(cè)時(shí)每孔加入20 μL（5 g/L）MTT，溫育4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上測(cè)490 nm處各孔的A值，計(jì)算生長(zhǎng)增殖率=（實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值－1）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組及以上數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR對(duì)GES-1細(xì)胞miR-200a/b/c及ZEB1、ZEB2 mRNA表達(dá)水平的影響 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR后，GES-1細(xì)胞中miR-200a/b/c表達(dá)水平較對(duì)照組及突變組明顯下降，以miR200b下調(diào)最為顯著（均P＜0.01），突變組較對(duì)照組無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖2。ZEB1及ZEB2 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組及突變組明顯上升（均P＜0.01），見(jiàn)圖3。

2.2 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR后ZEB1/ ZEB2蛋白表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR后，GES-1細(xì)胞中ZEB1和ZEB2蛋白相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組、突變組明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4、表2。

2.3 轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR及恢復(fù)miR-200b micmics表達(dá)后對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 ZEB2 3′UTR+ miR-200b micmics組miR-200b的表達(dá)水平高于其他3組，見(jiàn)圖5。Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后穿過(guò)微孔的平均細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果顯示，ZEB2 3′UTR組較對(duì)照組均明顯升高，而聯(lián)合miR-200b micmics后，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)較ZEB2 3′UTR組明顯減少（均P＜0.01），見(jiàn)圖6、表3。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h后ZEB2 3′UTR組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度明顯快于對(duì)照組，遷移率顯著升高，而恢復(fù)miR-200b表達(dá)后，其遷移能力有所下降（P＜0.01），見(jiàn)圖6、表3。且MMP2/9侵襲指標(biāo)也出現(xiàn)相應(yīng)變化，見(jiàn)圖7、表4。

Figure 2 Comparison of miR-200a/b/c expression levels between three groups圖2 各組細(xì)胞的miR-200a/b/c表達(dá)水平比較（n=3）

Figure 3 Comparison of ZEB1 and ZEB2 expression levels between three groups圖3 各組細(xì)胞的ZEB1、ZEB2表達(dá)水平比較（n=3）

Figure 4 The protein expression levels of ZEB1/ZEB2 in three groups圖4 3組細(xì)胞內(nèi)ZEB1/ZEB2蛋白表達(dá)水平

Table 2 Comparison of protein expression levels of ZEB1/ZEB2 between three groups表2 各組細(xì)胞中ZEB1/ZEB2蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Table 2 Comparison of protein expression levels of ZEB1/ZEB2 between three groups表2 各組細(xì)胞中ZEB1/ZEB2蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與突變組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組（1）突變組（2）ZEB2 3′UTR組（3）F ZEB1相對(duì)表達(dá)量0.23±0.02 0.22±0.01 0.41±0.07ab 35.344＊＊ZEB2相對(duì)表達(dá)量0.10±0.03 0.10±0.07 0.19±0.02ab 40.700＊＊

Figure 5 The expression levels of miR-200b evaluated by qRT-PCR in four groups圖5 qRT-PCR檢測(cè)不同處理組miR-200b的表達(dá)水平

Table 3 Comparison of the invasive capability and migrating rates after transfection between four groups表3 4組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力及細(xì)胞遷移率比較（n=3，±s）

Table 3 Comparison of the invasive capability and migrating rates after transfection between four groups表3 4組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力及細(xì)胞遷移率比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，P＜0.01；表4同

組別對(duì)照組（1）ZEB2 3′UTR組（2）ZEB2 3′UTR+無(wú)義序列組（3）ZEB2 3′UTR+200b micmics組（4）F穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)）45.67±3.21 76.33±3.78a 77.33±2.51a 47.33±3.79bc 81.353＊＊48 h遷移率（%）24.91±2.56 52.45±2.63a 54.01±3.10a 26.33±3.02bc 94.602＊＊

2.4 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性 4組之間A490值于第1天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.995，P＞0.05），第2～6天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為8.630、18.377、11.925、24.545、35.058，均 P＜0.01）；且ZEB2 3′UTR組A490值于第2～6天較對(duì)照組及ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics組顯著升高（均P＜0.01）；而ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics組A490值于第1～6天和對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖8。相應(yīng)反映增殖能力指標(biāo)的PCNA蛋白與生長(zhǎng)曲線一致，出現(xiàn)相應(yīng)變化，見(jiàn)圖7、表4。

Figure 6 Comparison of trans-membrane cell numbers and migrating rates between four groups（×100）圖6 4組細(xì)胞中穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)及遷移率比較（×100）

Figure 7 The protein expression levels of MMP2/9 and PCNA in four grouops圖74組細(xì)胞內(nèi)MMP2/9及PCNA蛋白表達(dá)水平

Figure 8 The growth curves of GES-1 in different groups圖8 不同處理組GES-1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

Table 4 Comparison of protein expression levels of MMP2/9 and PCNA between four groups表4 各組細(xì)胞中MMP2、MMP9和PCNA蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Table 4 Comparison of protein expression levels of MMP2/9 and PCNA between four groups表4 各組細(xì)胞中MMP2、MMP9和PCNA蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

組別對(duì)照組（1）ZEB2 3′UTR組（2）ZEB2 3′UTR+無(wú)義序列組（3）ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics組（4）F MMP2 0.28±0.02 0.53±0.01a 0.55±0.05a MMP9 0.36±0.03 0.69±0.03a 0.67±0.04a PCNA 0.63±0.03 1.03±0.05a 1.01±0.06a 0.30±0.03bc 77.993＊＊0.39±0.02bc 107.487＊＊0.66±0.02bc 69.147＊＊

3 討論

3.1 mRNA-miRNA反向作用的機(jī)制 近期提出的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceR?NA）假說(shuō)認(rèn)為：mRNA、被轉(zhuǎn)錄的假基因和長(zhǎng)的非編碼RNA之間能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)miRNA的方式進(jìn)行交互對(duì)話，這種作用依賴于“MREs”[6]。RNA之間通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相應(yīng)的miRNA，對(duì)該miRNA的后續(xù)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用發(fā)生有效的控制。Sumazin等[7]繪制出了惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，有超過(guò)7 000種基因編碼RNA以借助miRNA的方式發(fā)生了相互作用，與癌癥相關(guān)的基因起著重要的調(diào)控作用，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

3.2 3′UTR在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用 PTENP1的3′UTR及PTEN ceRNA ZEB2能與PTEN結(jié)合相同的miRNA，以miRNA依賴的方式調(diào)控細(xì)胞內(nèi)PTEN和P-Akt蛋白水平；其缺失可致PI3K/AKT信號(hào)激活，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[3,8]。外源性表達(dá)“miRNA海綿”能夠有效特異地抑制miRNA的功能[9]。含MREs的3′UTR具有強(qiáng)大的生物學(xué)活性，成為miRNA“誘餌”，螯合miRNA，從而影響它們對(duì)所表達(dá)的基因的調(diào)控。本研究中轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR后，ZEB1/ZEB2 mRNA及蛋白水平均升高，可能與上述機(jī)制有關(guān)。

3.3 ZEB2 3′UTR對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響及可能機(jī)制 本研究轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR質(zhì)粒后，miR-200a/b/c表達(dá)下調(diào)，以miR-200b降低最為明顯，此變化可能與2種因素有關(guān)：一方面，特異的miRNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)與miRNA結(jié)合后觸發(fā)miRNA加尾和3′→5′修剪及亞細(xì)胞定位而影響miRNA的穩(wěn)定性有關(guān)[10-11]；另一方面，ZEB1/ZEB2能結(jié)合miR-200b/200a/429啟動(dòng)子區(qū)以調(diào)節(jié)其表達(dá)[12]，ZEB2 3′UTR的導(dǎo)入引起miR-200家族表達(dá)降低，進(jìn)而減弱其對(duì)ZEB1/ZEB2的抑制作用，升高的ZEB1/ZEB2則進(jìn)一步加強(qiáng)了其對(duì)miR-200家族成員的表達(dá)抑制作用，形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)作用?；謴?fù)miR-200b表達(dá)后，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化能力部分被逆轉(zhuǎn)，ZEB2 3′UTR對(duì)miR-200b的調(diào)控可能是其發(fā)揮作用的主要機(jī)制之一。

ZEB2 3′UTR可以促進(jìn)人胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化傾向，此作用可能與轉(zhuǎn)染ZEB2 3′UTR后調(diào)控miR-200家族進(jìn)而影響相應(yīng)的靶基因ZEB1/ZEB2的表達(dá)有關(guān)。本研究證實(shí)了非編碼轉(zhuǎn)錄在基因規(guī)模上的影響，有望為抑制GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化提供新的途徑或方法。

[1] Seitz H.Redefining microRNA targets[J].Curr Biol,2009,19（10）: 870-873.doi:10.1016/j.cub.2009.03.059.

[2] Poliseno L,Salmena L,Zhang J,et al.A coding-independent func?tion of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology[J]. Nature,2010,465（7301）:1033-1038.doi:10.1038/nature09144.

[3]Tay Y,Kats L,Salmena L,et al.Coding-independent regulation of the tumor suppressor PTEN by competing endogenous mRNAs[J]. Cell,2011,147（2）:344-357.doi:10.1016/j.cell.2011.09.029.

[4]Cong N,Du P,Zhang A,et al.Downregulated microRNA-200a pro?motes EMT and tumor growth through the wnt/β-catenin pathway by targeting the E-cadherin repressors ZEB1/ZEB2 in gastric ade?nocarcinoma[J].Oncol Rep,2013,29（4）:1579-1587.doi:10.3892/ or.2013.2267.

[5]申發(fā)娟,蘇娟,張慶瑜,等.上調(diào)miR-200a、miR-141表達(dá)對(duì)胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的體外研究[J].天津醫(yī)藥,2013,41（6）:517-519.doi: 10.3969/j.issn.0253-9896.2013.06.002.

[6] Salmena L,Poliseno L,Tay Y,et al.A ceRNA hypothesis:the Ro?setta Stone of a hidden RNA language[J]?Cell,2011,146（3）:353-358.doi:10.1016/j.cell.2011.07.014.

[7] Sumazin P,Yang X,Chiu HS,et al.An extensive microRNA-medi?ated network of RNA-RNA interactions regulates established onco?genic pathways in glioblastoma[J].Cell,2011,147（2）:370-381. doi:10.1016/j.cell.2011.09.041.

[8]Karreth FA,Tay Y,Perna D,et al.In vivo identification of tumorsuppressive PTEN ceRNAs in an oncogenic BRAF-induced mouse model of melanoma[J].Cell,2011,147（2）:382-395.doi:10.1016/j. cell.2011.09.032.

[9]Ebert MS,Neilson JR,Sharp PA.MicroRNA sponges:competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells[J].Nat Methods,2007, 4（9）：721-726.

[10]Cazalla D,Yario T,Steitz JA.Down-regulation of a host microRNA by a Herpesvirus saimiri noncoding RNA[J].Science,2010,328（5985）:1563-1566.doi:10.1126/science.1187197.

[11]Ameres SL,Horwich MD,Hung JH,et al.Target RNA-directed trimming and tailing of small silencing RNAs[J].Science,2010,328（5985）:1534-1539.doi:10.1126/science.1187058.

[12]Bracken CP,Gregory PA,Kolesnikoff N,et al.A double-negative feedback loop between ZEB1-SIP1 and the microRNA-200 family regulates epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Res,2008,68（19）:7846-7854.doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-1942.