劉倩倩 劉運(yùn)德 張 瓊 李 雪 馮香梅 劉曉春 邸寶華 申艷娜

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是一 種人畜共患病的病原菌，可在免疫功能低下的個(gè)體中引起敗血癥等嚴(yán)重的感染性疾病[1]。機(jī)體主要利用固有免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答的協(xié)同作用對其進(jìn)行防御與清除[1-2]。炎癥復(fù)合體（inflammasome）是主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞內(nèi)的多蛋白復(fù)合物，可感知胞漿內(nèi)病原微生物代謝產(chǎn)物及宿主危險(xiǎn)信號[3-5]，招募并活化半胱氨酸蛋白酶caspase-1，進(jìn)而調(diào)控促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β的加工及活化。目前已發(fā)現(xiàn)NLRP1、NLRP3、AIM2、IPAF等4種炎癥小體[6-8]，其中NLRP3、AIM2、IPAF炎癥復(fù)合體在LM感染過程中被活化[9]。近年來有研究報(bào)道白色念珠菌、煙曲霉菌等真菌可通過蛋白酪氨酸激酶syk介導(dǎo)的信號通路來激活NLRP3炎癥復(fù)合體的活化[10-11]。本研究旨在探討LM感染過程中炎癥復(fù)合體的活化是否也通過蛋白酪氨酸激酶syk介導(dǎo)的信號通路調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物。清潔級C57BL/6雌性小鼠20只，7～12周齡，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，許可證編號：SCXK-(軍)2012-0004。（2）主要試劑。syk抑制劑BAY117082（BAY），P38MAPK抑制劑SB203580（SB），PI3K抑制劑wor?tamine（WO，Calbiochem）。巰基乙酸鹽肉湯，胰酶大豆瓊脂TSA，多聚甲醛，Polyclonal rabbit anti-mouse ASC抗體（Sig?ma-Aldrich），熒光二抗Alexa Fluro 594 donkey anti-rabbit IgG（invivogen），DAPI染液（Roche），磷酸化非受體型酪氨酸蛋白激酶（p-syk）抗體和非受體型酪氨酸蛋白激酶（t-syk）抗體，anti-rabbit HRP標(biāo)記IgG二抗（Cell Signaling Technology），慶大霉素（和研純化學(xué)株式會社），腦心浸液（BHI）和脫脂牛奶（Difco），胎牛血清FBS（Hyclone），IL-18酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（MBL）。（3）主要儀器。Nikon免疫熒光顯微鏡（Ni-U），Biotek酶標(biāo)儀（ELx-800），PowerPac Universal電泳儀電源、MiniPROTEIN tetraCell垂直電泳槽、TRANS-BLOT SD轉(zhuǎn)移電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離純化 小鼠腹腔內(nèi)注射3%巰基乙酸鹽肉湯3 mL，4 d后用RPMI1640 5 mL收集小鼠腹腔滲出細(xì)胞。1 000 r/min，4℃，離心5 min，洗滌2次，然后用10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，2 h后使用PBS洗去懸浮細(xì)胞，96%的貼壁細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。

1.2.2 LM野生株EGD的增殖與保存 LM野生株EGD（日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科微生物感染癥學(xué)所惠贈）BHI培養(yǎng)基中37℃過夜增菌。取1體積的過夜菌懸液加入到100體積的BHI培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4～5 h，加入PBS離心洗滌3次，將沉淀懸浮于含有10%甘油的PBS后分裝儲存于-80℃冰箱。3 d后隨機(jī)抽取3管LM，利用10倍倍比稀釋法檢測LM濃度，即菌液稀釋后涂布于胰酶大豆瓊脂（TSA）平板，37℃過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3 ELISA檢測 將小鼠腹腔滲出細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，分為陰性對照組（NI）、未處理組、BAY處理組、SB處理組、WO處理組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，對BAY處理組、SB處理組、WO處理組分別用抑制劑BAY、SB203580、wortamine預(yù)處理細(xì)胞1 h，除陰性對照組外，其余組按1×105cfu/孔的菌量加入LM感染30 min，再加入終濃度為10 mg/L的慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液，ELISA法檢測IL-18。

1.2.4 免疫熒光檢測 將小鼠腹腔滲出細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于已放置細(xì)胞爬片的12孔板，BAY處理組用抑制劑BAY預(yù)處理細(xì)胞1 h后，除陰性對照組外其余各孔均加入1×106cfu LM感染細(xì)胞30 min，然后加入終濃度為10 mg/L慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，加入抗ASC抗體室溫孵育2 h后，PBS洗滌4次，加入帶紅色熒光的二抗孵育2 h，PBS洗滌4次，DAPI染細(xì)胞核5 min，PBS洗滌4次，將玻片取出封埋。熒光顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)ASC-speck（紅色熒光高亮點(diǎn)）的形成個(gè)數(shù)，并計(jì)算出ASC-speck陽性細(xì)胞的百分比。

1.2.5 免疫印跡檢測 將小鼠腹腔滲出細(xì)胞以2×106個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板，按5×105cfu/孔的菌量加入LM感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞5、15、30 min，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白，行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，脫脂牛奶室溫下封閉2 h，用p-syk抗體或t-syk抗體4℃過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min，標(biāo)記HRP的IgG二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，暗室曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Figure 1 Effects of different inhibitors on the level of IL-18 during LM infection圖1 不同抑制劑處理對LM感染過程中IL-18的生成的影響（＊P＜0.05）

2.1 不同抑制劑對LM感染細(xì)胞產(chǎn)生IL-18水平的影響 見圖1。ELISA結(jié)果顯示BAY處理前后陰性對照組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-18蛋白表達(dá)水平無明顯變化（t=0.127，P＞0.05），而未處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞感染LM后產(chǎn)生的IL-18表達(dá)水平較陰性對照組顯著升高，BAY處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18蛋白水平則較未處理組下降（t=11.181，P＜0.05）；SB處理組、WO處理組、未處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.958,P＞0.05）。

2.2 BAY處理對LM感染巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)ASC-speck形成個(gè)數(shù)的影響 BAY處理組ASC-speck陽性細(xì)胞的百分比（1.27±1.07）%較未處理組ASC-speck陽性細(xì)胞的百分比（45.81±6.03）%明顯降低（t=41.109，P＜0.01），見圖2。

Figure 2 Comparison of the number of ASC-speck in macrophages pretreated with or without BAY after LM infection under immunofluorescence microscope（×40）圖2 熒光鏡下BAY處理前后LM感染巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)ASC-speck的形成個(gè)數(shù)比較（×40）

2.3 LM感染不同時(shí)相點(diǎn)t-syk蛋白表達(dá)及p-syk水平 Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，LM感染后t-syk蛋白表達(dá)無明顯差別，而p-syk水平在5、15、30 min時(shí)均有顯著增高，見圖3。

Figure 3 Expression levels of t-syk and p-syk in macrophages after LM infection at different time points圖3 LM感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞t-syk表達(dá)和p-syk水平隨時(shí)間的變化情況

3 討論

LM作為感染人群的重要病原微生物，可侵害多種機(jī)體細(xì)胞，尤其是固有免疫細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞，LM感染細(xì)胞后，進(jìn)入胞吞體，再借助李斯特菌溶血素（listeriolysin O,LLO）逃逸至胞漿內(nèi)生存并增殖[12]。而宿主細(xì)胞通過炎癥復(fù)合體中的關(guān)鍵蛋白識別胞漿內(nèi)病原微生物代謝產(chǎn)物，進(jìn)而激活caspase-1，促使炎性細(xì)胞因子IL-1b、IL-18等的成熟與分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而殺滅入侵機(jī)體的LM。在LM感染中可涉及3種炎癥小體，包括NLRP3、AIM2、IPAF炎癥復(fù)合體[9]，但是炎癥復(fù)合體形成的具體分子機(jī)制尚不明確。

新近研究表明真菌類如白色念珠菌（Candida albicans）、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）等可通過syk信號通路介導(dǎo)NLRP3炎癥復(fù)合體的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答[10-11]，本研究在此基礎(chǔ)上利用非受體型酪氨酸蛋白激酶syk及P38MAPK，PI3K信號蛋白激酶抑制劑BAY、SB、WO分別預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后感染LM，結(jié)果顯示僅BAY處理能顯著降低巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18水平，而SB和WO處理對IL-18表達(dá)沒有影響，表明syk信號通路而非PI3K、P38MAPK信號通路參與調(diào)控LM感染過程中IL-18的加工與成熟。

炎癥復(fù)合體是活化caspase-1所必需的分子平臺，其活化后，通過接頭蛋白ASC與胞內(nèi)的procas?pase-1蛋白結(jié)合，對procaspase-1進(jìn)行加工和激活，使宿主細(xì)胞產(chǎn)生依賴caspase-1活化的IL-18和IL-1β等細(xì)胞因子[8]。在LM感染過程中，LM是否是通過syk介導(dǎo)的信號通路調(diào)控炎癥復(fù)合體的活化來實(shí)現(xiàn)IL-18的生成仍不明確。近年研究報(bào)道炎癥復(fù)合體活化后可形成ASC-speck點(diǎn)狀聚集[13]，本研究顯示，在BAY處理組，LM感染后小鼠巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)ASC-speck陽性的細(xì)胞百分比較未處理組明顯降低，表明syk是通過調(diào)控ASC-依賴的炎癥復(fù)合體的活化調(diào)節(jié)IL-18的生成，并且syk在LM感染小鼠巨噬細(xì)胞的過程中對于炎癥復(fù)合體的形成發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步明確LM感染過程中syk的作用階段及活化程度，本研究利用Western blot檢測p-syk的水平，結(jié)果顯示LM感染最早期syk的磷酸化水平即有明顯升高，表明syk確實(shí)在LM感染過程中發(fā)揮作用，syk通過參與調(diào)控LM感染后炎癥復(fù)合體的裝配與活化，進(jìn)而促進(jìn)IL-18的表達(dá)。本研究結(jié)果與真菌類通過syk信號通路調(diào)節(jié)NLRP3炎癥復(fù)合體活化的研究結(jié)果一致[10-11]，說明syk不僅可以調(diào)控真菌類炎癥復(fù)合體的活化，而且調(diào)控細(xì)菌LM感染過程中炎癥復(fù)合體的活化。此外，在石棉、粉塵污染誘發(fā)的慢性肺炎[14]，以及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等過程中，NLRP3炎癥復(fù)合體的活化起著關(guān)鍵作用[15]，但其分子機(jī)制尚不清楚，本研究以及新近報(bào)道的真菌類研究將為這些炎癥的發(fā)病機(jī)制，以及臨床探索炎癥及感染性疾病的新干預(yù)途徑提供理論依據(jù)。

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