趙印生，趙永順

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧錦州121001;2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧大連116011)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，由于其具有侵襲性生長的特性，使得在神經(jīng)外科顯微手術(shù)中很難做到對腫瘤的完全切除，且膠質(zhì)瘤的級別也隨著手術(shù)次數(shù)和復發(fā)次數(shù)的增加而增加。近年來，對于低級別膠質(zhì)瘤大多主張顯微神經(jīng)外科手術(shù)盡可能全部切除，對于高級別膠質(zhì)瘤主張在盡可能全切的情況下，術(shù)后結(jié)合放化療，分子靶向治療等治療措施。

欖香烯(Elemene)是從中藥莪術(shù)中提取，主要成分為β-欖香烯，是中國自主開發(fā)的國家二類非細胞毒性抗腫瘤新藥，國內(nèi)有學者進行多年的臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯具有抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用［1-3］。但其對膠質(zhì)瘤細胞的抗腫瘤作用機制及作用靶點尚未明確，本實驗將通過觀察欖香烯對人源U87 膠質(zhì)瘤細胞的抑制增殖和誘導凋亡作用，以及欖香烯對人源U87 膠質(zhì)瘤細胞ERK 通路及該通路中關(guān)鍵分子復合體14 -3 -3/Raf -1 的影響，探討其抗膠質(zhì)瘤細胞的相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 材 料

2%欖香烯乳劑購自大連金港制藥公司;人源膠質(zhì)瘤U87 細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所;DMEM 培養(yǎng)基購自美國GIBCO BRL 公司;Raf-1、ERK、磷酸化ERK 蛋白質(zhì)單克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司;磷酸化Raf -1(Tyr340/341)、14 -3 -3、β-actin 蛋白質(zhì)單克隆抗體和Protein A/G PLUS-Agarose 購自Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng):將人源膠質(zhì)瘤U87 培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)基(青霉素50 U/mL，鏈霉素50 mg/mL)中，置37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 細胞增殖檢測:將對數(shù)生長期的人源膠質(zhì)瘤U87 以4 ×105/孔密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，分別加入藥物濃度為0、20、40、80 μg/mL 的欖香烯，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h。然后用胰酶消化，細胞計數(shù)儀(Beckman)計數(shù)，繪制生長曲線，以欖香烯質(zhì)量濃度0 μg/mL 為對照組。

1.2.3 免疫共沉淀:(1)取對數(shù)生長期的人源膠質(zhì)瘤U87 以4 ×105/孔密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后，以含欖香烯0、20、40、80 μg/mL 的培養(yǎng)液處理1 h。(2)吸掉培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 次(在冰上操作)，每孔加裂解緩沖液RIPA buffer［50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，1.0% NP -40，0.25% Na -deoxycholate，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L aprotinin，1 mg/mL PMSF，leupeptin and pepstatin］100 μL，刮除細胞后混勻30 min，12 000 r/min 離心5 min，取各組U87 總細胞裂解液(300 μL)，加入2 μg Raf-1 一抗(anti -Raf -1)混勻置于4 ℃下2 h。(3)加入20 μL 瓊脂糖偶聯(lián)蛋白懸浮液(Protein A/G PLUS -Agarose)，加蓋并置于搖床4 ℃下孵育12 h。(4)4 ℃下，1 000 r/min 離心30 min 后收集沉淀物。小心吸去上清，保留沉淀。(5)用RIPA 緩沖液漂洗沉淀5 次。每次漂洗都需重復離心步驟。(6)最后一次漂洗后，吸去上清，用電泳上樣緩沖液重懸浮沉淀物，煮浮樣品5 min，Western blot 檢測。

1.2.4 Western blot 檢測:(1)取對數(shù)生長期的人源膠質(zhì)瘤U87 以4 ×105/孔密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后，80 μg/mL 濃度的欖香烯共同孵育1 h。(2)吸掉培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 次(在冰上操作)，每孔加裂解緩沖液RIPA buffer［50 mmol/L Tris -HCl(pH 7.4)，1.0% NP -40，0.25% Na -deoxycholate，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L aprotinin，1 mg/mL PMSF，leupeptin and pepstatin］100 μL，刮除細胞后混勻30 min，離心，取上清，分光光度計檢測濃度，加入上樣緩沖液調(diào)至相同終濃度，94 ℃煮5 min。(3)配制10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠，上樣，60 V 電泳1 h，然后調(diào)至100 V 繼續(xù)電泳直至溴酚藍稍跑出，將蛋白從SDS 聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。(4)加一抗，4 ℃過夜。加二抗，室溫1 h。(5)ECL(Amersham)檢測，圖像定量分析軟件(Image Quant 5.2 software，Amersham)分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 欖香烯對U87 膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響

欖香烯對U87 膠質(zhì)瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用，在相同的處理時間內(nèi)(24 h)，欖香烯抗膠質(zhì)瘤增殖作用隨藥物濃度增大而增強(圖1A)，在藥物濃度為20 μg/mL 時，相對于空白對照具有抗增殖效應，在藥物濃度為80 μg/mL 時欖香烯達最大抗膠質(zhì)瘤效應，其細胞增殖抑制率約為(54. 4 ±1.9)% (P ＜0.05)，其IC50約為(83.2 ±4.3)μg/mL。在相同藥物濃度下(80 μg/mL)，欖香烯抗腫瘤效應隨著藥物作用時間延長而增強(圖1B)，其中在36 h 達到最大抗增殖效應，作用時間48 h 與36 h 組間無明顯差異(P ＞0.05)。

圖1 欖香烯抗U87 細胞增殖效應的濃度、時間依賴特點Fig 1 Dose- and time-dependent anti-glioma effect of elemene

2.2 欖香烯對U87 膠質(zhì)瘤細胞14 -3 -3/Raf -1分子復合體的影響

與對照組相比，經(jīng)各藥物組處理后的腫瘤細胞中參與形成Raf -1/14 -3 -3 復合物的分子伴侶14 -3 -3 量隨藥物濃度增大而減少，雖然當濃度為40 μg/mL 時參與形成Raf -1/14 -3 -3 復合物的分子伴侶14 -3 -3 量略高于20 μg/mL 濃度組，但兩組間比較差異無顯著性意義(P ＞0.05)(圖2)。在藥物濃度為80 μg/mL 時，Raf-1/14 -3 -3 形成量最少(P ＜0.05)。

圖2 欖香烯對U87 膠質(zhì)瘤細胞14 -3 -3/Raf-1 分子復合體形成的影響Fig 2 Impact of elemene on 14-3-3/Raf-1 complex formation

2.3 欖香烯對U87 細胞ERK 信號通路中關(guān)鍵蛋白表達的影響

欖香烯0、20、40、80 μg/mL 處理U87 細胞1 h后，各處理組間14 -3 - 3 蛋白表達無明顯差異(P ＞0.05)，欖香烯對U87 細胞總14 -3 -3 蛋白表達無影響，見圖3A。

經(jīng)欖香烯處理后的腫瘤細胞P-Raf-1 蛋白表達隨藥物濃度增大而下調(diào)，當藥物濃度為20 μg/mL時，給藥組與對照組無明顯差異(P ＞0.05)，當藥物濃度增大達40 μg/mL 時P -Raf -1 表達明顯下調(diào)(P ＜0.05)，并且在藥物濃度為80 μg/mL 中達最大抑制效應。見圖3B。

經(jīng)欖香烯處理后的腫瘤細胞磷酸化的ERK 和Raf-1 蛋白表達均隨藥物濃度的增大而下調(diào)(P ＜0.05)，見圖3C;但欖香烯對非磷酸化的ERK 和Raf-1 蛋白表達水平無明顯影響(P ＞0.05)。欖香烯下調(diào)U87 膠質(zhì)瘤細胞系Raf/MEK/ERK 信號通路關(guān)鍵蛋白表達。

3 討 論

圖3 欖香烯對U87 細胞ERK 信號通路中關(guān)鍵蛋白表達的影響Fig 3 Key proteins expression in ERK signal pathway after treatment by elemene

目前與腫瘤細胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲有密切關(guān)系的信號通路有MAPK 通路和PI3 K/Akt 通路［4-5］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen - activated protein kinases，MAPK)信號通路主要包括:Extracellular signal - regulated kinases(ERK1/2)，Jun N -terminal kinases (JNK)及p38MAPK 通路;其中ERK1/2 信號通路調(diào)控細胞生長和分化，是將胞外的生長和神經(jīng)營養(yǎng)信號傳到核內(nèi)的蛋白激酶級聯(lián)反應中的重要組分;JNK、p38MAPK 信號通路在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用［6］。

Ras 基因是人類原癌基因中突變率最高的基因，約占30%。在膠質(zhì)瘤細胞中，Ras 蛋白的活性增加對于MAPK/ERK 通路的激活至關(guān)重要［7］。Raf激酶的調(diào)控和激活方式如圖4所示(RTK 代表受體酪氨酸激酶)，活化型Ras -GTP 復合物結(jié)合激活Raf 激酶，后者將信號傳遞至MAPK 信號通路，14 -3 -3 蛋白是Raf 激酶信號傳遞調(diào)控中重要的蛋白。

圖4 Raf 激酶的調(diào)控和激活模式［8］Fig 4 The regulation and activation modle of Raf kinase

14 -3 -3 蛋白是細胞中廣泛表達的酸性蛋白家族，是細胞中含量最豐富的蛋白之一，最初發(fā)現(xiàn)于哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)腦脊液中，其在腫瘤形成及發(fā)展過程中高度表達具有誘導細胞產(chǎn)生惡性表型，促進癌細胞增殖的作用，使得癌細胞的形態(tài)變得更有侵襲性等重要的作用［9-10］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過欖香烯處理后，U87 膠質(zhì)瘤細胞中與Raf-1 結(jié)合并形成分子復合體的14 -3 -3蛋白水平下調(diào)，欖香烯阻礙14 -3 -3/Raf -1 分子復合體的形成;欖香烯可以下調(diào)U87 細胞中磷酸化的Raf-1 和ERK 蛋白表達。由此，推斷欖香烯對U87 細胞增殖抑制作用的機制是破壞了14 -3 -3蛋白對Raf-1 的分子結(jié)合功能，阻礙U87 細胞14 -3 -3/Raf-1 復合體的形成，使Raf -1 穩(wěn)定性受到破壞，結(jié)構(gòu)域不能暴露，Raf-1 不能與Ras -GTP 結(jié)合，不能被活化。為排除欖香烯使U87 細胞中與Raf-1 結(jié)合的14 -3 -3 下調(diào)是由于U87 細胞總14 -3 -3 表達水平降低引起的可能性，本研究檢測了欖香烯對U87 細胞總14 -3 -3 表達水平的影響，各組總14 -3 -3 表達無明顯差異(P ＞0.05)。提示欖香烯作用于U87 細胞可引起磷酸化ERK 和Raf-1 蛋白表達的下降，并提示隨著藥物作用劑量的增加，呈現(xiàn)漸進性降低。最終抑制U87 細胞賴以生存的Raf/MEK/ERK 通路，從而抑制其增殖。

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