姚康，張書(shū)寧，吳彥， 陸浩，黃浙勇， 錢(qián)菊英，鄒云增，葛均波

慢性充血性心力衰竭患者新型趨化因子循環(huán)Fractalkine及其受體CX3CR1水平研究*

姚康，張書(shū)寧，吳彥， 陸浩，黃浙勇， 錢(qián)菊英，鄒云增，葛均波

目的：觀察慢性充血性心力衰竭（CHF）患者新型趨化因子循環(huán)Fractalkine及其受體C3CXR1水平變化情況。

Fractalkine；慢性充血性心力衰竭；炎癥免疫

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:992.)

近年越來(lái)越多的證據(jù)表明，慢性充血性心力衰竭（CHF）是一種由各種炎癥介質(zhì)參與的復(fù)雜的炎癥免疫反應(yīng)過(guò)程，其中炎癥免疫細(xì)胞功能失調(diào)、免疫系統(tǒng)激活在心肌細(xì)胞損傷、基質(zhì)纖維化等心室重構(gòu)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[1-3]。既往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)多種炎癥免疫細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞參與其中，但其具體機(jī)制尚不明了。Fractalkine作為一種新型趨化因子通過(guò)與新型趨化因子受體（CX3CR1）結(jié)合，參與了單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移侵襲[4,5]，我們最近研究也發(fā)現(xiàn)[6,7]，循環(huán)Fractalkine與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)。本研究對(duì)慢性充血性心力衰竭患者Fractalkine/CX3CR1水平的變化做了探討。

1 資料與方法

對(duì)象：選取2009-08至2011-06來(lái)我院就診的慢性充血性心力衰竭患者（CHF組）55例，平均年齡（58±17）歲；男39例，女16例。其中缺血性心臟病16例，擴(kuò)張型心肌病18例,高血壓性心臟病10例，瓣膜性心臟病11例。入選標(biāo)準(zhǔn)為：①有心功能失代償?shù)呐R床表現(xiàn)，勞力性呼吸困難、端坐呼吸、下肢水腫等。②X線胸片示有肺淤血或水腫。③超聲心動(dòng)圖示收縮功能不全 （左心室射血分?jǐn)?shù)＜0.45）。④紐約心功能分級(jí)（NYHA）Ⅱ～Ⅳ級(jí)者。另選25例同期我院門(mén)診健康體檢者為正常對(duì)照組，男15例，女10例；平均年齡（56±18）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)（符合任一項(xiàng)）：急性心肌梗死1個(gè)月之內(nèi)、合并自身免疫性疾病、近期使用影響免疫反應(yīng)藥物者及嚴(yán)重肝功能和（或）腎功能不良患者。觀察內(nèi)容包括患者年齡、冠心病、高血壓、瓣膜病史、心功能分級(jí)情況等；藥物使用情況，包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、β受體阻滯劑、利尿劑、他汀類(lèi)藥物等。觀察用藥前及用藥后3個(gè)月患者血清可溶性Fractalkine水平變化。

血清可溶性Fractalkine和N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）水平測(cè)定：所有患者入院后24 h內(nèi)經(jīng)肘靜脈采血10 ml, 置于依地酸二鈉（EDTA）的試管中, 20℃ 447.2 g離心10 min, 取上層淡黃色血漿, -70℃低溫冰箱保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中可溶性新型趨化因子Fractalkine水平[8]。采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定血漿NT-proBNP水平。

受體CX3CR1水平檢測(cè)：①采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞受體CX3CR1的表達(dá)。淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），加入DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma公司）制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，取100 μl,加入30 μl抗體 CX3CR1-PE （美國(guó)Sigma公司），孵育洗滌。②BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD14+單核細(xì)胞CX3CR1的陽(yáng)性表達(dá)率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，率的比較采用χ2分析，血清可溶性Fractalkine與NT-proBNP水平的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析的方法，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

臨床特點(diǎn)及用藥情況：55例入選的慢性充血性心力衰竭患者臨床情況見(jiàn)表1。

表1 55例慢性充血性心力衰竭組患者臨床特點(diǎn)及用藥情況（例）

血清可溶性Fractalkine水平情況：①血清可溶性Fractalkine水平變化：CHF組（治療前）為（861±318） pg/ml 高于正常對(duì)照組（493±196）pg/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。②不同心功能的心力衰竭患者血清可溶性Fractalkine水平比較：由圖1可見(jiàn)，正常對(duì)照組、CHF組（心功能II、III、IV者），各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。③3個(gè)月標(biāo)準(zhǔn)治療后慢性充血性心力衰竭患者血清可溶性Fractalkine水平變化：CHF組為（643±277）pg/ml，較治療前下降，治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。而隨著NYHY程度加重，血清可溶性Fractalkine水平升高更加明顯[心功能Ⅱ級(jí)者：（626±204） pg/ml，Ⅲ級(jí)者：（894±252） pg/ml，Ⅳ級(jí)者：（1102±305） pg/ml，P＜0.01]，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示，血清可溶性Fractalkine的水平與NT-proBNP水平呈正相關(guān)（r=0.364, P＜0.01）。圖1、2

圖1 不同心功能的心力衰竭患者血清可溶性Fractalkine水平比較

圖2 3個(gè)月標(biāo)準(zhǔn)治療后慢性充血性心力衰竭患者血清可溶性Fractalkine水平變化

單核細(xì)胞受體CX3CR1的陽(yáng)性表達(dá)情況：各組外周血單個(gè)核細(xì)胞受體CX3CR1表達(dá)率水平無(wú)明顯差異。CD14+單核細(xì)胞受體CX3CR1陽(yáng)性表達(dá)率（圖3）：CHF組為（34.7±11.6）高于正常對(duì)照組（14.7±8.1）；并且隨著NYHY程度加重，表達(dá)水平增高[在NYHAⅡ級(jí)者為（25.1±12.4），與正常對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03），NYHAⅢ級(jí)者為（37.3±11.0），與NYHAⅡ級(jí)者比（P=0.04），N YHAⅣ級(jí)者為（41.7±11.1），與NYHAⅡ級(jí)者比（P=0.009）]。3個(gè)月標(biāo)準(zhǔn)治療后，CHF組CD14+單核細(xì)胞受體CX3CR1陽(yáng)性表達(dá)率（26.4±11.3）較治療前（34.7±11.6）下降，治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。

圖3 CD14+單核細(xì)胞受體CX3CR1的陽(yáng)性表達(dá)情況

3 討論

心力衰竭發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，神經(jīng)體液反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程參與其中，而持續(xù)性的炎癥、免疫反應(yīng)激活可能是上述各種機(jī)制的最終致病環(huán)節(jié)。在心力衰竭各個(gè)階段，尤其是早中期都能觀察到單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及NK細(xì)胞大量侵襲，這些激活的炎癥免疫細(xì)胞可通過(guò)釋放細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNFα），γ干擾素（IFNγ）進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步激活效應(yīng)細(xì)胞，釋放大量炎癥細(xì)胞因子。炎癥免疫細(xì)胞黏附和聚集主要依靠黏附分子和趨化因子，F(xiàn)ractalkine是新近發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子超家族，是CX3C家族唯一成員，它以膜結(jié)合的形式主要表達(dá)于受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞，最近發(fā)現(xiàn)也可被多種炎癥免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)，通過(guò)與受體CX3CR1結(jié)合，通過(guò)黏附和趨化作用促使炎癥免疫細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)、樹(shù)突狀細(xì)胞及NK細(xì)胞向炎癥免疫部位遷移；最近研究發(fā)現(xiàn)Fractalkine/CX3CR1與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及斑塊破裂密切相關(guān)[6-10]。而心力衰竭時(shí)Fractalkine/ CX3CR1的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)Fractalkine/ CX3CR1可能也參與了慢性充血性心力衰竭的炎癥免疫反應(yīng)過(guò)程。在心力衰竭患者中循環(huán)可溶性Fractalkine水平及單個(gè)核細(xì)胞CX3CR1均較正常對(duì)照組明顯增高，并且與患者臨床NYHA密切相關(guān)，心功能Ⅳ級(jí)水平顯著高于Ⅱ級(jí)，而與心力衰竭病因無(wú)明顯關(guān)系。Husberg等[11]曾經(jīng)對(duì)心力衰竭小鼠心肌中的Fractalkine及CX3CR1基因表達(dá)進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)顯著增強(qiáng)。循環(huán)Fractalkine水平增高考慮主要與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)外，還與心肌組織本身釋放有關(guān)，炎癥損傷時(shí)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞都可釋放Fractalkine，表達(dá)CX3CR1也增強(qiáng)[12,13]；Fractalkine還與心肌組織纖維化密切相關(guān)，通過(guò)蛋白激酶B（AKT）途徑及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路激活心房鈉尿肽（ANP）及β肌球蛋白重鏈（βMHC）表達(dá)[14-16]。我們的研究還發(fā)現(xiàn)指南規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)治療可降低慢性充血性心力衰竭患者外周循環(huán)Fractalkine/ CX3CR1表達(dá)，伴隨心功能改善，F(xiàn)ractalkine水平與血pro-BNP水平呈正相關(guān)。由于Fractalkine是炎癥免疫效應(yīng)細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及NK細(xì)胞的重要趨化因子，我們的研究提示Fractalkine/CX3CR1可能在心力衰竭的炎癥免疫發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在慢性充血性心力衰竭患者外周循環(huán)Fractalkine水平及單個(gè)核細(xì)胞CX3CR1表達(dá)明顯增高，并且Fractalkine水平與心臟功能密切相關(guān)。研究結(jié)果豐富了慢性充血性心力衰竭炎癥免疫發(fā)病機(jī)制，也為尋找新的預(yù)警指標(biāo)，以及探索可能的干預(yù)靶點(diǎn)提供了新的思路具有重要的臨床意義。

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Investigation of Circulating Fractalkine and its Receptor CX3CR1 Levels in Patients With Chronic Congestive Heart Failure

YAO Kang, ZHANG Shu-ning, WU Yan, LU Hao, HUANG Zhe-yong, QIAN Ju-ying, ZOU Yun-zeng, GE Jun-bo.
Department of Cardiology, Zhongshan Hospital Aff i liated to Fudan University, Shanghai (200023), China

GE Jun-bo, Email: ge.junbo2@zs-hospital.sh.cn

Objective: To observe the changes of circulating fractalkine and its receptor CX3CR1 level in patients with chronic congestive heart failure (CHF).Methods: Our work included 2 group, CHF group, n=55 patients and Control group, n=25 healthy subjects. Plasma level of soluble fractalkine (sFKN) was measured by ELISA, CX3CR1 in peripheral blood mononuclear cell was examined by fl ow cytometry method. The relationship between sFKN and NT-proBNP was studied.Results: Compared with Control group, CHF group had increased sFKN level, P=0.004, and the patients with NYHY III, IV were more than NYHY II, and CHF group also had the higher CX3CR1 expression (14.7 ± 8.1), P＜0.05. The CX3CR1 level increased accordingly with NYHY classif i cation, as the patients with NYHY II, CX3CR1 was at (25.1 ± 12.4), P=0.03 compare with Control group; with NYHY III, CX3CR1 was at (37.3 ± 11.0) , P=0.04 compared with NYHY II; with NYHY IV, CX3CR1 was at (41.7 ± 11.1), P=0.009 compared with NYHY II. The circulating sFKN level was positively related to pro-BNP level (r=0.364, P＜0.01).Conclusion: The circulating FKN l and its receptor CX3CR1 might be involved in pathogenesis of immune-inf l ammatory pathogenesis in CHF patients.

Fractalkine; Chronic heart failure; Immune-inf l ammatory

2013-12-31）

（編輯：梅平）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目資助（No.81470386） ；高等學(xué)校博士點(diǎn)新教師基金資助（No.20090071120027）

200023 上海市，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院 心內(nèi)科（姚康、張書(shū)寧、陸浩、黃浙勇、錢(qián)菊英、鄒云增、葛均波）；中國(guó)人民解放軍第85醫(yī)院 心內(nèi)科（吳彥）

姚康 副主任醫(yī)師 博士 主要從事冠心病基礎(chǔ)及臨床研究 Email：yao.kang@zs-hospital.sh.cn 通訊作者：葛均波 Email：ge.junbo2@zs-hospital.sh.cn

R541

A

1000-3614（2014）12-0992-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.009

方法：選取CHF患者 （CHF組） 55例和同期我院門(mén)診健康體檢者25例為正常對(duì)照組?；颊呷朐杭纯坛槿§o脈血，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清可溶性Fractalkine水平,流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞受體CX3CR1水平的表達(dá)；并對(duì)血清可溶性Fractalkine的水平與N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

結(jié)果：CHF組血清可溶性Fractalkine水平明顯高于正常對(duì)照組（P=0.004），紐約心功能分級(jí)（NYHY）Ⅲ、Ⅳ級(jí)者明顯高于Ⅱ級(jí)者；CHF組循環(huán)單個(gè)核細(xì)胞CX3CR1的表達(dá)水平較正常對(duì)照組(14.7±8.1)明顯增高（P＜0.05），并且隨著NYHY程度加重，表達(dá)水平亦明顯增高[NYHAⅡ級(jí)者為25.1±12.4，與正常對(duì)照組比（P=0.03）；Ⅲ級(jí)者為37.3±11.0，與NYHAⅡ級(jí)者比（P=0.04）；Ⅳ級(jí)者為41.7±11.1，與NYHAⅡ級(jí)者比（P=0.009），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義]。血清可溶性Fractalkine的水平與NT-proBNP水平呈正相關(guān)（r=0.364，P＜0.01）。

結(jié)論：循環(huán)Fractalkine及其受體CX3CR1可能參與了慢性充血性心力衰竭患者炎癥免疫發(fā)病過(guò)程。