岳麗霞 徐積兄

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其病理基礎(chǔ)主要是視網(wǎng)膜的缺血、缺氧，誘導(dǎo)新生血管形成，同時(shí)存在血管壁和血液流變學(xué)特性的改變[1-2]。DR作為一種多種因素相互作用的慢性并發(fā)癥，與長(zhǎng)期高血糖所致的多元醇代謝異常、蛋白質(zhì)非酶糖基化、氧化應(yīng)激增強(qiáng)和炎癥反應(yīng)等有關(guān)。DR機(jī)制尚未完全闡明，仍以嚴(yán)格的血糖控制、激光光凝、局部注射糖皮質(zhì)激素和抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、玻璃體切割術(shù)作為治療DR的主要措施。但上述預(yù)防和治療均有局限性和副作用，亟需探尋一種更有效的DR治療方法。近年來(lái)基因治療取得了很大進(jìn)步，人們對(duì)基因傳遞載體的安全性和生物分布的了解增多，隨著人類基因組計(jì)劃的完成及后基因組時(shí)代的進(jìn)步，可供選擇的治療基因數(shù)目也明顯增多。本文就DR的基因治療研究進(jìn)展作一綜述。

1 基因療法

隨著基因治療研究的逐漸深入，基因療法將為許多疾病的治療提供新的思路。經(jīng)典的基因治療是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病。然而，現(xiàn)在越來(lái)越多的研究是借助病毒載體(包括各種逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒、皰疹病毒、痘病毒等)，將目的基因插入病毒基因的非必需區(qū)形成重組病毒顆粒，通過回體轉(zhuǎn)移或直接轉(zhuǎn)移將目的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，以達(dá)到基因治療的目的。但上述載體各有其優(yōu)缺點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄病毒能有效地將目的基因整合進(jìn)被感染細(xì)胞的基因組，但靶細(xì)胞必須處于增殖狀態(tài)；腺病毒載體因其具有包裝容量較大、制備方便且易純化和濃縮、宿主范圍廣、感染效率高等特點(diǎn)，在基因治療中作用廣泛，但因其載體不能和宿主細(xì)胞發(fā)生整合，導(dǎo)致外源基因只能瞬時(shí)表達(dá)，需重復(fù)使用，同時(shí)可誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，并且存在體內(nèi)復(fù)制的可能，有安全隱患；腺相關(guān)病毒雖無(wú)免疫排斥反應(yīng)和細(xì)胞毒作用，但是其載體制備純化需要的技術(shù)含量高，感染效率低，并且包裝容量有限；慢病毒能穩(wěn)定地整合入宿主染色體，持久穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，但其不能沾染有復(fù)制能力的病毒，否則會(huì)造成嚴(yán)重后果[3]。其他還包括皰疹病毒和痘病毒等，均能造成不同程度的嚴(yán)重后果。上述各種整合載體插入后可能存在導(dǎo)致腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，所以，現(xiàn)在已經(jīng)研究出高刪除、自失活、非整合的慢病毒載體作為更安全的替代品。還有一些非病毒眼部基因轉(zhuǎn)移方式備受關(guān)注，優(yōu)勢(shì)是：(1)轉(zhuǎn)移時(shí)受基因大小的影響較小；(2)和病毒載體不同的是不存在安全性問題；包括利用DNA納米粒子，ΦC31整合系統(tǒng)，電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，并且已在眼內(nèi)成功應(yīng)用[4]。當(dāng)前針對(duì)DR基因治療研究較多的是將外源基因?qū)寡軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[5]、色素上皮衍生因子(pigment epithelial dervied factor，PEDF)[6-7]、血管抑素(angiostatin，AS)、內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)[8]，以抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而抑制新生血管的形成，達(dá)到治療視網(wǎng)膜病變的目的。

2 DR相關(guān)基因

2.1VEGFVEGF是一種具有高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，一種強(qiáng)效的血管生成因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)血管形成、增加血管通透性等多種生物學(xué)功能。通過與特異性受體(vascular endothelial growth factor recptor，VEGFR)結(jié)合，介導(dǎo)蛋白酶激C(protein kinase C，PKC)途徑，而發(fā)揮其生物學(xué)功能。生理狀態(tài)下，視網(wǎng)膜的周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞低表達(dá)VEGF，維持眼部血管的完整性。在缺血、缺氧等因素影響下，誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)升高，且其表達(dá)量和視網(wǎng)膜新生血管形成的嚴(yán)重程度成正比[9]。臨床發(fā)現(xiàn)，與這些改變有顯著相關(guān)的基因有RAGE、整合素α2β1。同時(shí)有研究表明，VEGF的基因多態(tài)性也與DR相關(guān)[9]，SNP-2578C/A中AA基因型與DR顯著相關(guān)[10]。VEGF啟動(dòng)區(qū)-634C/G位點(diǎn)的基因多態(tài)性與DR的發(fā)生有密切關(guān)系，而且此位點(diǎn)可能是促使血漿中VEGF升高的主要原因[11]。可溶性受體FLT-1(sFLT-1)是特異性VEGF抑制劑，PEDF、血管抑素、金屬蛋白酶組織抑制物-3(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-3，TIMP-3)也具有抗血管生成的作用。大多數(shù)眼內(nèi)抗新生血管形成治療策略主要集中在抑制VEGF活性方面，但是從基因?qū)用鎭?lái)阻斷DR的進(jìn)展，尚未見報(bào)道，因此，DR的基因治療逐漸被關(guān)注和重視。Colella等[12]以VEGF轉(zhuǎn)基因?qū)僮鳛槟Ｐ停孟傧嚓P(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體介導(dǎo)可溶性受體sFlt-1編碼基因轉(zhuǎn)移，通過將該載體注射到視網(wǎng)膜下腔，使治療基因在被注射的眼內(nèi)表達(dá)，有效地抑制了視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常的發(fā)生。Ambati等[13]以ROP小鼠為模型，分別采用腺病毒和AAV載體介導(dǎo)sFlt-1基因轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示正常的小鼠眼部低表達(dá)VEGF，高表達(dá)sFlt-1，同時(shí)sFlt-1抑制VEGF的表達(dá)，對(duì)眼部起到保護(hù)作用。然而，在ROP小鼠眼內(nèi)VEGF表達(dá)量顯著升高，而sFlt-1則受抑制，實(shí)驗(yàn)通過病毒介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)sFlt-1基因的高表達(dá)，對(duì)ROP小鼠起到治療作用[13-15]。

2.2PEDF基因PEDF是一種含418個(gè)氨基酸的糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，具有多種生物學(xué)活性。在糖尿病并發(fā)癥中，PEDF發(fā)揮新生血管的抑制、抗炎、抗氧化、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用。PEDF主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜，在房水和玻璃體內(nèi)也有較高濃度的PEDF[16]。PEDF不僅能抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷徙，減少眼內(nèi)的血管性出血，還能抑制缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管化，同時(shí)能避免機(jī)械、激光和缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷，抑制VEGF體外誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷徙，促進(jìn)視網(wǎng)膜的修復(fù)[17-18]。在眼內(nèi)，PEDF含量與VEGF含量保持著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系，PEDF的下降可使VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂活性占支配地位，導(dǎo)致糖尿病中血管滲漏和新生血管形成。有研究顯示，PEDF可以顯著降低VEGF在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮和Müller細(xì)胞中的表達(dá)；另一方面，VEGF通過其受體介導(dǎo)的過程可以顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PEDF的表達(dá)[16]。

2.3AS和ES基因在血管生成抑制因子中除了PEDF，AS和ES也被發(fā)現(xiàn)可以特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，AS和ES具有抑制趨化作用，而不影響能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖/存活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]。ES可作用于內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡、遷徙過程，抑制VEGF的作用，從而抑制新生血管形成。LeGat等[19]通過在高壓氧誘導(dǎo)的DR小鼠模型玻璃體內(nèi)注射攜帶ES基因的腺病毒載體，成功抑制視網(wǎng)膜新生血管形成。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)由AAV介導(dǎo)的PEDF、ES、TIMP-3基因轉(zhuǎn)移，在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)模型[20]中對(duì)新生血管形成也產(chǎn)生抑制作用，但介導(dǎo)的TIMP-3抑制作用較AAV介導(dǎo)的PEDF或ES基因轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的作用略低。

2.4晚期糖基化終末產(chǎn)物受體基因糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一種具有多配體的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面分子。不僅可與糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)結(jié)合，還可與其他配體如兩性素/高速泳動(dòng)族盒1蛋白(HMGB1)、S100/鈣粒蛋白等結(jié)合而發(fā)揮作用。AGEs與RAGE結(jié)合，激活JAK-STAT、MAPKs、Ras-Rac-Cdc42、(PI3-K)-Akt/PKB 旁路途徑而發(fā)揮作用，如增加血管通透性、促進(jìn)細(xì)胞因子釋放、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、減輕NO的舒張血管作用、促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化等作用，最終導(dǎo)致糖尿病血管病變?nèi)鐒?dòng)脈粥樣硬化、腎臟病變、視網(wǎng)膜病變等的發(fā)生發(fā)展[21]。內(nèi)源分泌型RAGE(endogenous secretory receptor for advanced glycation end products，esRAGE)是RAGE基因的一種可變剪接體，缺少胞內(nèi)段和跨膜區(qū)域，但存在于配體結(jié)合的胞外段，不能向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RAGE的配體AGEs。因此，esRAGE作為RAGE-AGEs系統(tǒng)的重要抑制物，提高視網(wǎng)膜局部esRAGE可阻止或延緩DR的發(fā)生發(fā)展[22]。

2.5醛糖還原酶基因醛糖還原酶(aldose reductase，AR)是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的以NADPH為輔酶的單體酶，屬于AR超家族的一員，大量存在于周細(xì)胞中，廣泛存在于血管、腎臟、心臟、腦、骨骼肌、視網(wǎng)膜、胎盤、神經(jīng)等組織中[2]，以煙酸酰胺嘌呤二核苷磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)為輔酶催化多種醛類、酮類物質(zhì)還原為醇，參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖過程。AR通過多元醇通路引起糖尿病微血管損傷[23]。研究發(fā)現(xiàn)[24]，AR抑制劑可以減弱氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NF-kB活化和AP1信號(hào)，從而減輕因NF-kB活化和AP1信號(hào)引起的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長(zhǎng)，但是療效有限?；虻倪z傳變異在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)[25]，醛糖還原酶基因(aldo-keto reductase family 1，member B1，AKR1B1)的遺傳變異與DR密切相關(guān)，rs9640883與糖尿病病程、DR顯著相關(guān)，通過影響糖尿病病程、血壓、BMI、視網(wǎng)膜功能、血清膽固醇水平和糖化血紅蛋白水平，間接影響DR發(fā)生發(fā)展。

2.6血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE) 是一種Zn2+依賴型羧二肽酶，為膜整合的單鏈糖蛋白，其功能主要通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)介導(dǎo)，而在DR中，RAS系統(tǒng)平衡受損。有研究表明[26]，通過克隆ACE2/Ang-(1-7)AAV體(AAV-ACE2/Ang-(1-7))，增加了視網(wǎng)膜內(nèi)ACE2/Ang-(1-7)表達(dá)，能夠起到防治DR的作用。在AAV-ACE2/Ang-(1-7)治療糖尿病小鼠2個(gè)月后，無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管10倍增生，其能顯著降低DR的發(fā)生，同時(shí)阻止基底膜的增厚。同時(shí)在糖尿病大鼠得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，其毛細(xì)血管5倍增生，AAV-ACE2/Ang-(1-7)通過基因傳遞治療幾乎能完全阻止無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管形成，且對(duì)體質(zhì)量、血糖、血壓無(wú)影響。AAV載體通過增加視網(wǎng)膜內(nèi)ACE2和Ang-(1-7)的表達(dá)水平，從而阻止糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管通透性、基底膜增厚、視網(wǎng)膜炎癥、無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管形成和氧化損傷。同時(shí)觀察到在小鼠糖尿病模型中能顯著改善血糖、血壓和其他相關(guān)并發(fā)癥。增加眼內(nèi)RAS系統(tǒng)軸的ACE2/Ang-(1-7)表達(dá)，可以作為DR的一個(gè)新的治療目標(biāo)[26]。

2.7一氧化氮合酶基因一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase，NOS)是NO合成的關(guān)鍵酶，NO是可調(diào)節(jié)眼底微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)，維持視網(wǎng)膜血管的張力，使血管舒張，阻止白細(xì)胞和血小板侵犯血管壁，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前對(duì)NOS基因與DR進(jìn)展相關(guān)性研究最多的是NOS亞型基因，如eNOS和iNOS。研究發(fā)現(xiàn)[27]，在敲除eNOS基因的糖尿病小鼠中，與同齡的C57BL/6小鼠相比，eNOS基因敲除的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的血管滲透性明顯增加，顯示出早期發(fā)病和無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管數(shù)量增加、持續(xù)膠質(zhì)增生、毛細(xì)血管基底膜增厚，伴隨著總NO水平升高和視網(wǎng)膜iNOS的表達(dá)增加。同時(shí)研究表明，eNOS基因T-786C、Glu298Asp基因多態(tài)性與DR進(jìn)展密切相關(guān)[28]。

2.8促紅細(xì)胞生成素基因促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種單鏈的酸性糖蛋白，不僅可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞和紅系祖細(xì)胞的增生，還能誘導(dǎo)分化，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成，其在缺血、缺氧狀態(tài)下，具有神經(jīng)元保護(hù)及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育作用[29]。在DR的發(fā)生發(fā)展中，EPO表達(dá)明顯增高，同時(shí)顯示出能刺激因缺氧引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和新生血管的形成。在視網(wǎng)膜和內(nèi)皮細(xì)胞中有EPO受體，EPO通過與其受體結(jié)合，依賴蛋白酪氨酸激酶(tyrosine protein kinases，TPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活來(lái)發(fā)揮其作用。研究表明[30]，通過使用EPO抑制劑，能明顯改善新生血管的形成。同時(shí)，單核苷酸多態(tài)性對(duì)EPO表達(dá)的影響較大，并且EPO在玻璃體內(nèi)和血漿中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性，使得識(shí)別EPO基因標(biāo)記開發(fā)新的治療及預(yù)防療法成為可能。Takagi等[9]證實(shí)EPO在增殖性DR中增加，在ROP中，抑制EPO與抑制VEGF同樣有效。

2.9酪氨酸激酶-2基因酪氨酸激酶-2(Tie-2)表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)血管的重塑和成熟，其配體Ang-1和Ang-2的平衡決定了Tie-2的磷酸化狀態(tài)。同時(shí)調(diào)節(jié)內(nèi)皮的屏障功能、血管分支、炎癥反應(yīng)和血管生成。Ang-1被認(rèn)為是Tie-2的活化劑，而Ang-2是拮抗Tie-2上Ang-1活動(dòng)的同源配體。在血管形成階段，Ang-1的表達(dá)出現(xiàn)在血管成熟的早期，引起內(nèi)皮細(xì)胞分化和招募周細(xì)胞前體，以穩(wěn)定新生血管。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞遷移和促進(jìn)細(xì)胞分化的最后成熟步驟。成人血管重塑涉及VEGF和Ang-1與Ang-2之間比例的相互作用。Ang-2在引起周細(xì)胞丟失方面起著重要作用，在缺氧環(huán)境中Ang-2的表達(dá)上調(diào)[9]。

3 其他

誘導(dǎo)TXNIP轉(zhuǎn)基因沉默和改善病理影響途徑而開辟新的治療策略，旨在阻止DR的發(fā)生發(fā)展。糖尿病特征是血-視網(wǎng)膜屏障的破壞、新生血管形成、神經(jīng)膠質(zhì)功能障礙和神經(jīng)元死亡[31]。

4 問題與展望

目前DR的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，針對(duì)DR基因治療可選擇的基因也越來(lái)越多，如：VEGF、RAGE、PEDF、ACE、EPO、NOS、醛糖還原酶基因、Tie-2基因等，但基因治療依然存在需要深入研究和解決的技術(shù)性問題，同時(shí)依賴于基因治療技術(shù)本身的進(jìn)步。目前運(yùn)用較多的AAV、腺病毒(AD)、慢病毒均有各自的優(yōu)勢(shì)和局限性，三種整合載體插入均可能增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此，更安全有效的基因轉(zhuǎn)移方式是目前基因治療的主要研究方向。與此同時(shí)，載體構(gòu)建和導(dǎo)入的高效性有待于進(jìn)一步提高，目的基因的毒性和免疫原性及作用的靶細(xì)胞和切入點(diǎn)均有待于進(jìn)一步觀察和研究。由此尋找與DR發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的、切實(shí)有效的目的基因，以進(jìn)一步了解DR的發(fā)病機(jī)制。目前，大多數(shù)研究仍局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，大鼠、小鼠、兔仍然是實(shí)驗(yàn)的主要研究對(duì)象，并且取得了一定的進(jìn)展。但進(jìn)行臨床應(yīng)用還需要克服許多實(shí)際的困難，如病毒載體的毒性作用及誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加、注射部位及不同注射部位下用藥劑量和時(shí)間間隔的問題，均有待于進(jìn)一步研究。然而，隨著基因治療相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)與DR密切相關(guān)的基因的深入研究，基因治療將會(huì)為DR患者帶來(lái)福音。

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