6株乳酸菌在豆乳中的發(fā)酵特性

張莉麗，崔 憲，馬 微，劉容旭，韓建春,3,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東寧出入境檢驗檢疫局，黑龍江 東寧 157200；3.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

6株乳酸菌在豆乳中的發(fā)酵特性

張莉麗1，崔 憲1，馬 微2，劉容旭1，韓建春1,3,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東寧出入境檢驗檢疫局，黑龍江 東寧 157200；3.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、短乳桿菌（L. brevis）、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）、植物乳桿菌（L. plantarum）、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）和保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus）分別發(fā)酵豆乳，測定發(fā)酵期間pH值、滴定酸度、游離氨基氮，發(fā)酵結(jié)束后的活菌數(shù)和質(zhì)構(gòu)參數(shù)，并且對所得產(chǎn)品進行感官評價。結(jié)果表明：發(fā)酵過程中前5 株菌發(fā)酵豆乳的pH值顯著下降，而L. bulgaricus下降緩慢，發(fā)酵24 h pH值僅為5.2。這6 株菌發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)均達到1.0×108CFU/mL以上。結(jié)果表明L. casei、L. brevis、L. acidophilus和L. plantarum發(fā)酵得到的產(chǎn)品的堅實度、稠度、黏度、黏附性指數(shù)均較高，感官評定結(jié)果表明這4 株菌發(fā)酵豆乳產(chǎn)品得分均較高，容易被消費者接受，適合用于生產(chǎn)發(fā)酵豆乳產(chǎn)品。

乳酸菌；豆乳；發(fā)酵特性

大豆含有豐富的植物蛋白、不飽和脂肪酸、膳食纖維、異黃酮和維生素等功能成分，且不含膽固醇和乳糖，較牛乳而言更適用于高血壓和乳糖不耐癥人群[1]，是一種高營養(yǎng)價值的天然植物蛋白食品。豆乳是中國常見的飲品，雖然它營養(yǎng)豐富，但是不易貯存，而且低溫貯存會產(chǎn)生明顯的豆腥味[2-4]。目前研究表明豆乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后形成的產(chǎn)品不僅能改善豆乳特有的豆腥味，產(chǎn)生降血壓活性肽[5]、有益于胃腸健康低聚糖[6-7]、具有神經(jīng)抑制功能的γ-氨基丁酸等促進人體健康的活性物質(zhì)[8-10]，而且能使糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為生物活性更高的游離型大豆異黃酮[9-11]。

為了開發(fā)新型發(fā)酵豆乳產(chǎn)品，本實驗以L. casei、L. brevis、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus和L. bulgaricus分別發(fā)酵豆乳，測定發(fā)酵期間pH值、滴定酸度、游離氨基氮、發(fā)酵結(jié)束后的活菌數(shù)和質(zhì)構(gòu)參數(shù)，并且對所得產(chǎn)品進行了感觀評價，為發(fā)酵豆乳的研發(fā)和生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ATCC11842、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC393、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）KLDS1.0373、嗜酸乳桿菌（Lactcbacillus acidophilus）ATCC 4356、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KLDS1.0391、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）ATCC7469 工業(yè)微生物菌種保藏中心保存。

液體MRS培養(yǎng)基用于菌種活化，固體MRS培養(yǎng)基用于菌種活菌數(shù)檢測。

大豆乳培養(yǎng)基：豆質(zhì)量與蒸餾水體積比為1：10，磨成豆?jié){，用于菌種活化和發(fā)酵劑制備[7]。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10型精密酸度計 德國賽多利斯公司；Ultrospec 1100 pro型紫外-可見分光光度計 美國GE公司；TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司；高壓均質(zhì)機SRH60-70 上海申鹿均質(zhì)機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將乳酸菌按3%體積比接種于試管MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，活化1～3 次，使培養(yǎng)時間在12～18 h內(nèi)活菌數(shù)達到1×108CFU/mL以上。將5%試管MRS菌液接種于100～300 mL三角瓶大豆乳培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，乳酸菌在大豆乳培養(yǎng)基中分別在8～10 h凝乳后即為單菌母發(fā)酵劑。

1.3.2 工藝流程與技術(shù)路線[12]

選豆（挑選表面光澤無霉?fàn)€變質(zhì)的大豆）→蒸餾水浸泡→堿水浸泡（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25 % NaHCO3溶液浸泡8 h）→磨漿去渣→調(diào)配（添加質(zhì)量濃度65 g/L的蔗糖）→均質(zhì)（25 MPa、10 min）→殺菌（100 ℃，10 min）→冷卻→大豆乳發(fā)酵培養(yǎng)基→接入母發(fā)酵劑→pH值至4.6終止發(fā)酵→后熟（4 ℃）。

1.3.3 測定方法

1.3.3.1 pH值測定

采用PB-10酸度計直接測定。

1.3.3.2 滴定酸度

準(zhǔn)確稱量5.00 g發(fā)酵豆乳樣品，置于100 mL三角瓶中，加入40 mL去CO2水，再加入2滴的0.5%酚酞乙醇溶液，小心搖勻，用濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色在30 s內(nèi)不消失為止。消耗的濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)除以樣品克數(shù)，再乘以1 000，即得酸度（°T）[13]，取3 次測定的平均值。

1.3.3.3 活菌計數(shù)[14]

將發(fā)酵樣品用滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定倍數(shù)后采用MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法，37 ℃培養(yǎng)72 h計菌落總數(shù)，測定各菌株活菌數(shù)。

1.3.3.4 游離氨基氮

游離氨基氮的測定采用鄰苯二甲醛衍生比色法。參照Church等[15]的方法，在340 nm波長處用分光光度計測定吸光度，確定游離氨基氮質(zhì)量濃度。

1.3.3.5 質(zhì)構(gòu)測定[16]

發(fā)酵豆乳凝固后放入冰箱，4 ℃冷藏24 h后，采用質(zhì)構(gòu)分析儀測量酸奶的堅實度、稠度、黏度、粘附性指數(shù)，研究不同發(fā)酵菌種對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)的影響。TPA測定參數(shù)如下：測定前探頭速度1.00 mm/s；測定時探頭速度1.00 mm/s；測定后探頭速度1.00 mm/s；測定距離20 mm；探頭柱型AEC，盤徑35 mm；感應(yīng)力Auto-5 g；數(shù)據(jù)攫取速度200 pps。

1.3.3.6 感官評價

參照王水泉等[17]方法，由5 名男生和5 名女生組成感官鑒評小組，并接受感官鑒定培訓(xùn)。小組成員要求對酸豆乳的表觀、氣味、風(fēng)味和質(zhì)地指標(biāo)進行評價。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH值變化

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳pH值變化Fig.1 Changes in pH of soybean milk fermented by different lactic acid bacteria

由圖1可知，發(fā)酵過程中除L. bulgaricus外，其他各菌株發(fā)酵豆乳的pH值均顯著下降。其中，L. rhamnosus和L. brevis發(fā)酵390 min到達發(fā)酵終點（pH 4.6），pH值下降速率為0.308 h-1；而L. casei、L. acidophilus 和L. plantarum分別發(fā)酵440、450、480 min到達終點，pH值下降速率分別為0.273、0.267、0.250 h-1；而L. bulgaricus發(fā)酵過程中pH值先升高后下降，而且下降緩慢，發(fā)酵到480 min，pH值仍為5.79，即使進一步發(fā)酵到24 h時pH值為5.2，仍沒有達到4.6。

2.2 發(fā)酵過程中滴定酸度變化

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳滴定酸度的變化Fig.2 Changes in titratable acidity of soybean milk fermented by different lactic acid bacteria

由圖2可知，發(fā)酵過程中除L. bulgaricus外，其他各菌株發(fā)酵豆乳的滴定酸度均顯著升高。其中，L. brevis發(fā)酵到達終點（pH 4.6）時滴定酸度最高，達39.86 °T；其次是L. plantarum（37.99 °T）；隨后是L. rhamnosus、L. acidophilus和L. casei，其滴定酸度分別為36.93、33.88、33.48 °T，而L. bulgaricus發(fā)酵24 h滴定酸度僅為22.11 °T。

2.3 不同乳酸菌對發(fā)酵豆乳中活菌數(shù)的影響

圖3 不同乳酸菌對發(fā)酵豆乳中活菌數(shù)的影響Fig.3 Changes in viable bacterial counts of soybean milk fermented by different lactic acid bacteria

為開發(fā)含活菌的低溫產(chǎn)品，以發(fā)酵后熟產(chǎn)品的活菌數(shù)作為衡量發(fā)酵豆乳產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，對L. casei、L. brevis、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus分別發(fā)酵豆乳至終點（pH 4.6），L.bulgaricus發(fā)酵24 h后再經(jīng)24 h（4℃）后熟所得的發(fā)酵豆乳進行活菌數(shù)測定，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，L. brevis、L. acidophilus和L. rhamnosus發(fā)酵后的活菌數(shù)顯著高于L. bulgaricus和 L. plantarum的發(fā)酵豆乳，所有發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)均高于1.0×108CFU/mL。

2.4 不同乳酸菌對發(fā)酵豆乳中游離氨基氮的影響

圖4 不同乳酸菌對發(fā)酵豆乳中游離氨基氮的影響Fig.4 Changes in free amino nitrogen content of soybean milk fermented by different lactic acid bacteria

以L. casei、L. brevis、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus分別發(fā)酵豆乳至終點（pH 4.6），L. bulgaricus發(fā)酵24 h后測定游離氨基氮含量，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，L. bulgaricus在豆乳中的生長能力較弱，產(chǎn)酸能力也很弱，但發(fā)酵豆乳中的游離氨基氮最多。除此之外，L. brevis發(fā)酵豆乳中的游離氨基氮顯著地高于其他菌，達（4.10±0.20）mmol/L，其次為L. acidophilus和L. rhamnosus，最后為L. casei和L. plantarum。這些結(jié)果表明除L. bulgaricus外，發(fā)酵終點的游離氨基氮含量越高，乳酸菌數(shù)量越多，另外還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中，隨著乳酸菌的生長，游離氨基氮含量下降（數(shù)據(jù)未列出），這可能是由于發(fā)酵豆乳中的游離氨基氮促進了乳酸菌的生長，這一結(jié)果與Shihata等[18]的結(jié)論一致，豆乳中益生菌的生長依賴于蛋白的水解能力。因此，向豆乳中添加乳清蛋白濃縮物或者酪蛋白酸性水解物可能會提高乳酸菌的生長能力，縮短發(fā)酵時間[19]。但此結(jié)果與文獻[20]結(jié)果相反，可能是由于發(fā)酵菌種和發(fā)酵條件不同造成的。

2.5 不同乳酸菌對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)的影響

利用質(zhì)構(gòu)儀來測試酸奶的堅實度、稠度、黏度、黏附性指數(shù)。由表1可知，L. bulgaricus發(fā)酵豆乳的硬度、稠度、黏度和黏附性指數(shù)均明顯低于其他樣品，這可能是由于此樣品的酸度不足導(dǎo)致凝乳不結(jié)實造成的。通過對比可知，L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus發(fā)酵豆乳的硬度明顯高于L. casei和L. brevis發(fā)酵的樣品。發(fā)酵豆乳的稠度變化規(guī)律是：L. rhamnosus顯著高于L. acidophilus、L. plantarum、L. brevis和L. casei；L. rhamnosus、L. plantarum、L. brevis和L. casei發(fā)酵豆乳黏度較高，其次為L. acidophilus，L. bulgaricus發(fā)酵豆乳的黏度最低；L. brevis和L. casei發(fā)酵豆乳的黏附性指數(shù)顯著高于其他樣品；L. rhamnosus發(fā)酵豆乳的硬度、稠度、黏度均較高，但其黏附性指數(shù)顯著低于其他樣品。

表1 不同乳酸菌對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Changes in texture parameters of soybean milk fermented by different lactic acid bacteria

2.6 不同乳酸菌對感官評定的影響

以L. casei、L. brevis、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus分別發(fā)酵豆乳至終點（pH 4.6），L. bulgaricus發(fā)酵24 h后，放入4 ℃冰箱貯藏24 h后，進行感官評價，結(jié)果如圖5所示。L. casei和L. brevis發(fā)酵豆乳得分最高，而L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus稍次之，L. bulgaricus發(fā)酵豆乳得分最低。L. casei和L. brevis發(fā)酵產(chǎn)品無乳清析出，表面細膩，感官總體得分顯著高于其他發(fā)酵產(chǎn)品，它們發(fā)酵產(chǎn)品無酸臭味和豆腥味，酸味適中，氣味總體得分顯著高于其他產(chǎn)品。L. plantarum和L. rhamnosus發(fā)酵的產(chǎn)品略有豆腥味。而L. bulgaricus發(fā)酵后的產(chǎn)品豆腥味濃，并且有其他異味，質(zhì)地也較差，因此感官評分最低。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳的感官評分Fig.5 Changes in sensory evaluation of soybean milk fermented by different lactic acid bacteria

3 結(jié) 論

以L. casei、L. brevis、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus分別發(fā)酵豆乳至pH 4.6，L. bulgaricus發(fā)酵24 h，發(fā)酵期間前5 種菌pH值和游離氨基氮顯著下降，而L. bulgaricus下降緩慢，發(fā)酵24 h pH值僅為5.2。這6 株菌發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)均達到1.0×108CFU/mL以上。質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果表明L. casei、L. brevis、L. acidophilus和L. plantarum發(fā)酵得到的產(chǎn)品的堅實度、稠度、黏度、黏附性指數(shù)均較高，L. rhamnosus發(fā)酵豆乳的堅實度、稠度和黏度較高，但其黏附性指數(shù)很低，L. bulgaricus發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)參數(shù)均很低。感官評定結(jié)果表明L. casei、 L. brevis、L. acidophilus、L. plantarum發(fā)酵豆乳產(chǎn)品無乳清析出，表面細膩，表觀與質(zhì)地的感官得分與質(zhì)構(gòu)參數(shù)測定的數(shù)值相一致；L. rhamnosus發(fā)酵豆乳的黏附性指數(shù)很低，因此，其表觀與質(zhì)地的感官評分較低。另外L. casei、L. brevis、L. acidophilus、L. plantarum這4 株菌發(fā)酵產(chǎn)品無酸臭味、酸味適中，沒有或略有豆腥味，容易被消費者接受，適合用于生產(chǎn)發(fā)酵豆乳，為開發(fā)含活菌的低溫產(chǎn)品提供參考。

[1] SCALABRINI P, ROSSI M, SPETTOLI P, et al. Characterization of Bifidobacterium strains for use in soymilk fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology, 1998, 39(3): 213-219.

[2] GüLER Z, GüRSOy-BALCI A C. Evaluation of volatile compounds and free fatty acids in set types yogurts made of ewes’, goats’ milk and their mixture using two different commercial starter cultures during refrigerated storage[J]. Food Chemistry, 2011, 127(3): 1065-1071.

[3] MURTI T W, BOUILLANNE C, LANDON M, et al. Bacterial growth and volatile compounds in yoghurt-type products from soymilk containing Bifidobacterium ssp.[J]. Journal of Food Science, 1993, 58(1): 153-157.

[4] 張佳, 馬永昆, 崔鳳杰, 等. 乳酸菌發(fā)酵酸豆乳香氣成分分析及評價[J].食品科學(xué), 2010, 31(20): 298-303.

[5] MARAZZA J A, NAZARENO M A, de GIORI G S, et al. Enhancement of the antioxidant capacity of soymilk by fermentation with Lactobacillus rhamnosus[J]. Journal of Functional Foods, 2012, 4(3): 594-601.

[6] 田三德, 劉愛香, 楊大慶, 等. 發(fā)酵豆乳改善胃腸道消化功能的研究[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報, 2004, 22(2): 35-38.

[7] HATI S, VIJ S, MANDAL S, et al. Galactosidase activity and oligosaccharides utilization by lactobacilli during fermentation of soy milk[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2013, 38(3): 1065-1071.

[8] LAI L R, HSIEH S C, HUANG H y, et al. Effect of lactic fermentation on the total phenolic, saponin and phytic acid contents as well as anti-colon cancer cell proliferation activity of soymilk[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013, 115(5): 552-556.

[9] DING W K, SHAH N P. Enhancing the biotransformation of isoflavones in soymilk supplemented with lactose using probiotic bacteria during extended fermentation[J]. Journal of Food Science, 2010, 75(3): M140-M149.

[10] TELANG A M, JOSHI V S, SUTAR N, et al. Enhancement of biological properties of soymilk by fermentation[J]. Food Biotechnology, 2010, 24(4): 375-387.

[11] REKHA C R, VIJAyALAKSHMI G. Bioconversion of isoflavone glycosides to aglycones, mineral bioavailability and vitamin b complex in fermented soymilk by probiotic bacteria and yeast[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 109(4): 1198-1208.

[12] 徐寅, 黃玉軍, 顧瑞霞, 等. 乳酸菌對發(fā)酵豆乳風(fēng)味成分的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(5): 91-95.

[13] XUE Han, ZHANG Lanwei, DU Ming, et al. Effects of copper on the post acidif i cation of fermented milk by St. thermophilus[J]. Journal of Food Science, 2012, 77(1): M25-M28.

[14] BAO yan, ZHANG yong, LI Haiping, et al. in vitro Screen of Lactobacillus plantarum as probiotic bacteria and their fermented characteristics in soymilk[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(3): 1311-1320.

[15] CHURCH F C, SWAISGOOD H E, PORTER D H, et al. Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J]. Journal of Dairy Science, 1983, 66(6): 1219-1227.

[16] ZHANG L, yI H, DU M, et al. Enzymatic characterization of transglutaminase from Streptomyces mobaraensis dsm 40587 in high salt and effect of enzymatic cross-linking of yak milk proteins on functional properties of stirred yogurt[J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95(7): 3559-3568.

[17] 王水泉, 包艷, 張延超, 等. 具有潛在益生特性的發(fā)酵乳桿菌在豆乳中的發(fā)酵特性[J]. 中國乳品工業(yè), 2010, 38(5): 7-12.

[18] SHIHATA A, SHAH N P. Proteolytic prof i les of yogurt and probiotic bacteria[J]. International Dairy Journal, 2000, 10(5/6): 401-408.

[19] DAVE R I, SHAH N P. Ingredient supplementation effects on viability of probiotic bacteria in yogurt[J]. Journal of Dairy Science, 1998, 81(11): 2804-2816.

[20] LI Haiping, yAN Liya, WANG Jicheng, et al. Fermentation characteristics of six probiotic strains in soymilk[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(4): 1473-1483.

Fermentation Characteristics of Different Lactic Acid Bacteria in Soymilk

ZHANG Li-li1, CUI Xian1, MA Wei2, LIU Rong-xu1, HAN Jian-chun1,3,*
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Dongning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dongning 157200, China; 3. The National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150030, China)

In this paper, Lactobacillus casei, L. brevis, L. acidophilus, L. plantarum, L. rhamnosus and L. bulgaricus were individually used to ferment soymilk. Changes in pH, titratable acidity and free amino nitrogen during fermentation were determined. The viable counts of bacteria, texture parameters and sensory evaluation of soymilk fermented by lactic acid bacteria were measured. The results showed that pH values of the soymilk fermented by the fi rst fi ve strains were decreased significantly during the fermentation. However, pH of L. bulgaricus was decreased slowly and reached 5.2 at 24 h of fermentation. Viable counts of the soymilk fermented by these six strains reached more than 1.0×108CFU/mL. Texture analysis showed that the stability, consistency, viscosity, and adhesion index of the soymilk yoghurt produced with L. casei, L. brevis, L. acidophilus and L. plantarum were higher. Sensory evaluation results indicated that the fermented soymilk produced with these four strains had higher scores and could be accepted by consumers easily. Thus, these four strains could be suitable for the production of fermented soymilk products.

lactic acid bacteria; soymilk; fermentation characteristics

TS214.2

A

1002-6630（2014）15-0141-04

10.7506/spkx1002-6630-201415029

2014-06-26

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102208）

張莉麗（1981—），女，講師，博士，研究方向為蛋白質(zhì)工程和發(fā)酵工程。E-mail：lilizhang2011@163.com

*通信作者：韓建春（1973—），男，教授，博士，研究方向為蛋白質(zhì)工程和發(fā)酵工程。E-mail：hanjianchun@hotmail.com