郭永輝，姜建國，閆 凱，韓學(xué)靜（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011）

比沙可啶為2010年版《中國藥典》收載的品種，是目前臨床上廣泛使用的通便劑。本文參考2010年版《中國藥典》及有關(guān)文獻(xiàn)[1-7]，采用高效液相色譜（HPLC）法與非水溶液電位滴定法對比沙可啶的純度進(jìn)行了測定。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范及相關(guān)計(jì)量技術(shù)規(guī)范要求，分別對HPLC法與非水溶液電位滴定法測定比沙可啶純度的過程進(jìn)行不確定度評定，并將兩種不同原理方法的測定結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合定值及不確定度評定。最終確定的比沙可啶純度值及其不確定度值準(zhǔn)確可靠，更加準(zhǔn)確地反映了比沙可啶的真實(shí)純度，有利于提高藥品的質(zhì)控水平，同時(shí)對比沙可啶純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制與標(biāo)定賦值提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695 HPLC儀（美國Waters公司）；DL-50自動電位滴定儀、XS105電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

比沙可啶原料藥樣品（河北康泰藥業(yè)有限公司，批號：130501，規(guī)格：每瓶10 g，HPLC純度：99.9%）；鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)試劑（KHP）為優(yōu)級純，高氯酸、無水冰醋酸、醋酸酐均為分析純，結(jié)晶紫為試劑純，乙腈為色譜純，水為自制超純水。

2 HPLC法測定

2.1 色譜條件

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC條件[8]，采用與文獻(xiàn)不同的色譜柱，優(yōu)化了流動相比例，對比沙可啶純度進(jìn)行測定。色譜柱為Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈-水（60 ∶40，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為265 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10μl，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為1 000μg/ml。記錄色譜圖及峰面積，利用面積歸一化法進(jìn)行純度測定。比沙可啶的HPLC圖譜見圖1。

圖1 比沙可啶的HPLC圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of bisacodyl

2.2 方法學(xué)研究

2.2.1 供試品溶液的制備。精密稱取樣品25 mg，置于25 ml量瓶中，加流動相溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 000.0μg/ml的溶液，即得。

2.2.2 線性關(guān)系考察。精密稱取樣品50.0 mg置于25 ml量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為2 000.0μg/ml的貯備液；分別精密移取0.05、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0 ml至10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，獲得7種質(zhì)量濃度樣品溶液（10.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μg/ml）。進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積。以樣品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝7 743.2x+62 935（r＝1.000 0，n＝7）。結(jié)果表明，比沙可啶檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10.0～2 000.0μg/ml。

2.2.3 儀器精密度試驗(yàn)。取供試品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄主峰面積，計(jì)算其RSD為0.19%（n＝6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.4 方法重復(fù)性試驗(yàn)。平行配制6份供試品溶液，每份重復(fù)進(jìn)樣3次，結(jié)果6份樣品的峰面積平均值的RSD＝0.44%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 峰純度考察。根據(jù)比沙可啶二極管陣列檢測器（DAD）光譜圖，其最大吸收波長為220、265 nm。2個(gè)波長下檢出的色譜圖純度值均為99.88%，但在265 nm波長下比沙可啶主峰響應(yīng)值高，基線平穩(wěn)，無溶劑影響，且主成分色譜峰與雜質(zhì)峰可達(dá)基線分離。故選取265 nm波長作為HPLC法的檢測波長。比沙可啶的DAD光譜圖見圖2。

圖2 比沙可啶的DAD光譜圖Fig 2 DAD chromatogram of bisacodyl

2.3 純度標(biāo)準(zhǔn)值的確定

2.3.1 數(shù)學(xué)模型。應(yīng)用HPLC面積歸一化法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的純度測定，根據(jù)面積歸一化法計(jì)算公式，確定比沙可啶純度計(jì)算數(shù)學(xué)模型：WHPLC＝A化合物色譜峰面積/A總色譜峰面積×100%。式中：WHPLC表示化合物的相對純度，A化合物色譜峰面積表示被測化合物色譜峰面積值，A總色譜峰面積表示被測化合物加各雜質(zhì)成分的色譜峰面積之和。

2.3.2 純度測定。①測定方法。按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行配制10份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每份重復(fù)進(jìn)樣3次。比沙可啶色譜峰面積平均值為7 949 449，相對純度平均值為99.88%，總色譜峰面積平均值為7 959 193（詳細(xì)數(shù)據(jù)略）。②格拉布斯檢驗(yàn)。將10組檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)，進(jìn)行可疑值的剔除。將10組測量純度數(shù)據(jù)按從小到大的順序排列，可疑值不是最小值就是最大值。計(jì)算平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）。計(jì)算偏離值：平均值與最小值之差為a1；最大值與平均值之差為a2。確定可疑值，即比較a1和a2，其中最大值確定為可疑值。純度平均值為99.88%，s＝5.683 3×10－5。經(jīng)計(jì)算，格拉布斯G值為1.760。查格拉布斯臨界值表[5]知：G0.95（10）＝2.176。G＜G0.95（10），故在兩組數(shù)據(jù)中無可疑值存在。③標(biāo)準(zhǔn)值。由比沙可啶的純度測量數(shù)據(jù)確定比沙可啶HPLC面積歸一化純度值為99.88%，10組測量數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差為：s＝5.683×10－5。

2.4 其他雜質(zhì)測定

由于HPLC面積歸一化法測定純度值的局限性，樣品中的水分、無機(jī)雜質(zhì)和溶劑殘留均無法檢測，因此參照2010年版《中國藥典》附錄，分別采用卡爾費(fèi)休水分測定法[1]、熾灼殘?jiān)鼨z查法[1]、氣相色譜法[1]進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)的檢測。結(jié)果表明，樣品中水分含量為0.020%、熾灼殘?jiān)鼮?.036%、溶劑殘留為0.015%，合計(jì)0.071%。最終可得比沙可啶HPLC法純度標(biāo)準(zhǔn)值x1為：99.88%×（100%－0.071%）＝99.81%。

2.5 HPLC法不確定度評估

HPLC法引入的不確定度由“2.3.1”項(xiàng)下的數(shù)學(xué)模型可知，主要是由色譜峰面積引入，其中包含了由天平、量瓶以及色譜儀等因素帶來的各種影響因素。峰面積的不確定度計(jì)算公式為，式中u（A色譜峰）表示色譜峰引入的不確定度，s色譜峰表示色譜峰標(biāo)準(zhǔn)偏差，10表示測定次數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC法合成不確定度計(jì)算公式為：uc（x1）＝式中，uc（x1）表示合成不確定度，WHPLC表示化合物的相對純度，u（A主峰）表示色譜主峰面積引入的不確定度值，u（A總色譜峰）表示色譜總峰面積引入的不確定度值，A主峰表示10組主色譜峰面積均值，A總色譜峰表示10組總色譜峰面積均值。

根據(jù)“2.3.2①”項(xiàng)中的相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算，可得到HPLC法合成不確定度值為：uc（x1）＝0.141%。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)JJF 1059-1999[2]，當(dāng)不確定度分布為均勻分布且置信概率P為0.95時(shí)，擴(kuò)展不確定度的包含因子k＝2，其擴(kuò)展不確定度為：U（x1）＝k×uc（x1）＝2×0.141%＝0.282。

綜上，比沙可啶HPLC法純度標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度分別為99.81%、（±）0.29%（k＝2，P＝0.95）。

3 非水溶液電位滴定法測定

3.1 測定方法

取樣品約0.30 g，精密稱定，加無水冰醋酸25 ml溶解，加萘酚苯甲醇指示液2滴，照2010年版《中國藥典》附錄ⅦB非水溶液滴定法[1]，在磁力攪拌下用0.1 mol/L高氯酸滴定液滴定，記錄消耗滴定液的體積，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，計(jì)算結(jié)果。本研究選擇電位法指示終點(diǎn)，并采用萘酚苯甲醇為指示劑進(jìn)行滴定終點(diǎn)的輔助判斷，溶液顯黃綠色即為滴定終點(diǎn)。此方法不確定度具體評定過程將另文報(bào)道。

3.2 數(shù)學(xué)模型

以比沙可啶含量計(jì)算公式作為不確定度評定的數(shù)學(xué)模型。比沙可啶含量計(jì)算公式：A＝c×（V－V0）×M/m×100%。式中：A為以無水物計(jì)算所得比沙可啶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）；c為高氯酸滴定液的濃度（mol/L）；V為供試品消耗滴定液的體積（ml）；V0為空白試驗(yàn)消耗滴定液的體積（ml）；M為無水比沙可啶的摩爾質(zhì)量（g/mol）；m為供試品稱樣量（g）。

3.3 純度標(biāo)準(zhǔn)值的確定

按照“3.1”項(xiàng)下測定方法，雙人（甲、乙）獨(dú)立操作，每人測定10組，共20組測定數(shù)據(jù)。20組檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)，無可疑值。由比沙可啶的純度測量數(shù)據(jù)，確定非水溶液電位滴定法純度值x2為99.82%，s＝5.016×10－4。

3.4 非水溶液電位滴定法不確定度評估

不確定度各合成分量貢獻(xiàn)分析結(jié)果見表1。

表1 比沙可啶含量測定的不確定度評定結(jié)果Tab 1 Uncertainty evaluation of content determination of bisacodyl

計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：uc（x2）＝0.254%。P為0.95時(shí)，k＝2，其擴(kuò)展不確定度：U（x2）＝k×uc（x2）＝2×0.254%＝0.508%。

綜上，比沙可啶非水溶液電位滴定法純度標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度分別為99.82%、（±）0.51%（k＝2，P＝0.95）。

4 兩種方法的純度標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度

4.1 純度標(biāo)準(zhǔn)值

使用t檢驗(yàn)方法對不同原理獲得的純度值進(jìn)行比較，檢查結(jié)果的一致性。經(jīng)計(jì)算t＝0.88，自由度n＝21。查t分布雙側(cè)分位數(shù)表知＝2.08，兩種方法間t檢驗(yàn)計(jì)算結(jié)果，t值小于臨界值，表明兩種方法數(shù)據(jù)結(jié)果一致。故取兩種方法的平均值作為比沙可啶的純度標(biāo)準(zhǔn)值，即（99.82%+99.81%）/2＝99.82%。

4.2 兩種不同原理方法總不確定度

根據(jù)CNAS-GL06化學(xué)分析中不確定度的評估指南[3]與相關(guān)文獻(xiàn)[7]，兩種不同原理方法總合成不確定度計(jì)算公式為：

式中，u（cx）表示合成不確定度，表示純度標(biāo)準(zhǔn)值，uc（x1）表示HPLC法合成不確定度，x1表示HPLC法純度標(biāo)準(zhǔn)值，uc（x2）表示非水溶液電位滴定法合成不確定度，x2表示非水溶液電位滴定法純度標(biāo)準(zhǔn)值。計(jì)算結(jié)果為uc（x）＝0.291%。P為0.95時(shí)，k＝2，其擴(kuò)展不確定度為：

U（x）＝k×uc（x）＝2×0.291%＝0.582%。

4.3 比沙可啶含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度

比沙可啶含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度分別為99.82%、（±）0.59%（k＝2，P＝0.95）。

5 討論

（1）在比沙可啶HPLC法不確定度評定過程中，水分、無機(jī)雜質(zhì)和溶劑殘留的含量測定值均較小（小于0.1%），對純度標(biāo)準(zhǔn)值的定值結(jié)果幾乎無影響，所以由其引入的不確定度可以忽略不計(jì)。

（2）本文采用HPLC和非水溶液電位滴定法兩種不同原理的分析方法聯(lián)合測定比沙可啶純度值，有效地避免了采用一種技術(shù)帶來的分析方法缺陷，使定值結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

（3）非水溶液電位滴定法為2010年版《中國藥典》（二部）中測定比沙可啶純度的法定方法，HPLC面積歸一化法為測定比沙可啶純度的經(jīng)典方法，建立其不確定度評定方法十分重要，同時(shí)也為比沙可啶純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和標(biāo)定賦值工作提供了科學(xué)依據(jù)。本文建立的不確定度評估數(shù)學(xué)模型和定值方法與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制水平接軌，同時(shí)也為其他藥物進(jìn)行純度測量、不確定度模型建立及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評定提供了一定的參考。

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