商宏偉，李 嵐，孫盛斌，肖穎彬，劉 梅

·基礎(chǔ)研究·

大鼠體外循環(huán)后小腸黏膜基質(zhì)金屬蛋白酶9及其組織型抑制劑1表達與腸屏障功能的關(guān)系

商宏偉，李 嵐，孫盛斌，肖穎彬，劉 梅

目的 探討大鼠體外循環(huán)（CPB）后小腸黏膜基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）及其組織型抑制劑（TIMP－1）表達與腸屏障功能的關(guān)系，為CPB后腸屏障功能保護提供新靶點。方法 健康成年雄性清潔級SD大鼠40只隨機分為CPB組（n＝20）和假手術(shù)組（SH組，n＝20）。另取10只作為正常對照組（N組）。分光光度法測定CPB后血漿二胺氧化酶（DAO）活性，轉(zhuǎn)錄酶－逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)斑跡法檢測腸黏膜MMP－9，TIMP－1的mRNA和蛋白表達變化，明膠酶譜法測定腸黏膜MMP－9活性變化，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 CPB組血漿中DAO活性比SH組和N組顯著增高（P＜0.05）；RT－PCR顯示CPB組小腸黏膜MMP－9 mRNA表達水平較N組和SH組明顯增加（P＜0.01）；CPB組TIMP－1 mRNA表達水平與N組和SH組無顯著差異（P＞0.05）；Western blot顯示CPB組MMP－9蛋白表達顯著高于SH組和N組（P＜0.01）；三組之間TIMP－1蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，CPB組小腸黏膜組織中MMP－9、MMP－2活性與SH和N組比較，均顯著增強（P＜0.01）；線性回歸及相關(guān)分析結(jié)果顯示：CPB后腸黏膜組織MMP－9活性和血漿DAO活性呈顯著正相關(guān)（r＝0.821，P＜0.01）。結(jié)論 CPB后小腸黏膜MMP－9表達上調(diào)及其酶活性增加導(dǎo)致MMP－9／TIMP－1失衡在腸屏障功能障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用。調(diào)控MMP－9活性有可能成為CPB過程中腸屏障功能保護新靶點。

體外循環(huán)；大鼠；基質(zhì)金屬蛋白酶；腸黏膜屏障

腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官和重要靶器官。研究表明體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）后早期即可出現(xiàn)腸黏膜屏障功能的損害，是造成CPB后全身性炎癥反應(yīng)（systemic inflammatory response syn?drome，SIRS）發(fā)生發(fā)展的重要原因之一［1－2］。CPB引起腸黏膜細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）各成分，如基底膜層粘連蛋白（LN）、Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原等含量下降、結(jié)構(gòu)破壞也是腸屏障功能損害的重要因素［3－4］。但是造成ECM損害的具體機制尚不清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組鋅離子和鈣離子依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶，是降解ECM的主要酶系。金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的內(nèi)源性特異性組織抑制劑［5］。本研究擬通過觀察大鼠CPB后腸源性MMP－9／TIMP－1表達情況，探討其與腸屏障功能的關(guān)系，進一步闡明腸屏障損害發(fā)生機制，為腸屏障功能保護提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 大鼠CPB模型［6］

1.1.1 實驗動物 成年健康雄性清潔級SD大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，體重350～500 g。術(shù)前6 h禁食水。

1.1.2 手術(shù)方法 同參考文獻［4］。

1.2 實驗分組 隨機分為CPB組（n＝20）、假手術(shù)組（SH組，僅在各部位進行插管操作，不轉(zhuǎn)流，n＝20）和正常對照組（N組，n＝10）。

1.3 標本留取及處理 CPB結(jié)束后2 h處死動物，無菌條件下取腸系膜上靜脈血分離血漿－70℃保存待測；取距回盲部5 cm的回腸腸段2 cm，按黎君友［7］方法進行腸組織勻漿，－70℃保存；另取腸段2 cm，作病理分析。

1.4 血漿二胺氧化酶（DAO）活性 按照黎君友［7］等建立的分光光度法測定；由于CPB使用的血液稀釋對各指標濃度的影響，用以下公式校正：校正值＝測定值×轉(zhuǎn)流前紅細胞比容（Hct）／測定時Hct。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR） Tripure RNA提取試劑盒（Roche公司，美國）提取小腸黏膜組織總RNA，RT－PCR試劑盒（TaKaRa，日本）行PCR擴增反應(yīng)，GAPDH引物（退火溫度：61.4℃，231 bp）：正義5＇－ACG GCA AAT TCA ACG GCA CAG TCA－3＇；反義5＇－TGG GGG CAT CGG CAG AAG G－3＇；MMP－9引物（退火溫度：66.9℃，545 bp）：正義5＇－GAA GAC TTG CCG CGA GAC GTG ATC GAT G－3＇；反義5＇－GCA CCA GCG ATA ACC ATC CGA GCG AC－3＇；TIMP－1引物（退火溫度：59.8℃，219 bp）：正義5＇－AAT GCC ACA GGT TTC CGG TTC－3＇；反義5＇－ACA CCC CAC AGC CAG CAC TAT－3＇。按以下條件進行PCR反應(yīng)：MMP－9／TIMP－1／GAP?DH（磷酸甘油醛脫氫酶）：94℃ 變性2 min，然后按照下列循環(huán)條件進行擴增：94℃變性1 min－66℃／59℃／61℃退火1 min－72℃延伸1 min，循環(huán)32次。最后在72℃延伸10 min，取出反應(yīng)管置4℃10 min，即可進行電泳。用引物擴增cDNA片段，并與內(nèi)參照（GAPDH）同時擴增。PCR擴增完畢后，進行瓊脂糖凝膠電泳（1.5%加入0.6 μg／ml EB），確定PCR反應(yīng)產(chǎn)物。電泳結(jié)果掃入凝膠成像系統(tǒng)并照相進行分析，結(jié)果以光密度值比值（OD ratio，目的片段／GAPDH）表示。

1.6 蛋白質(zhì)斑跡法（Western blot） RIPA裂解液抽提小腸黏膜組織總蛋白；BCA法測定蛋白濃度；按照十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠試劑盒（碧云天公司）說明書進行SDSPAGE凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜；封閉；加兔抗鼠一抗體，搖床4℃孵育過夜；洗膜；加HRP標記的羊抗兔IgG二抗，室溫搖動1 h；洗膜；雙抗體（DAB）顯色5～10 min，出現(xiàn)清晰條帶。凝膠掃描成像系統(tǒng)進行分析，蛋白表達量結(jié)果以光密度（Odu?mm2）比值（OD ra?tio，目的片段／GAPDH）表示。

1.7 明膠酶譜分析（Gelatin Zymography）［8］

1.7.1 小腸組織液提取 液氮中取出小腸腸段，冰生理鹽水沖洗3次，平皿中刮取腸黏膜組織25 mg，移入玻璃勻漿器，加入蛋白質(zhì)勻漿緩沖液2 ml；冰上研磨，10 000 rpm，4℃離心5 min；取上清液，用0.1M的Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.6；于試管中加入考馬斯亮藍染液 3 ml和蛋白上清液5 μl，混勻后用Beckmann紫外分光光度計測定蛋白濃度；上清液轉(zhuǎn)移至另一個EP管（100～200 μl／管），－70℃凍存。

1.7.2 明膠酶譜法測定 配制12%非還原性SDS－聚丙烯酰胺凝膠，其中含0.1%明膠；在上述混合液中加入APS和四甲基乙二胺（TEMED），室溫下聚合，灌注分離膠；然后4%無酶底物聚丙烯酰胺灌注積層膠；取5 μl上樣（上樣緩沖液中不應(yīng)用DTT以免使得蛋白變性無法復(fù)性）進行SDS－PAGE電泳。以胰蛋白酶、蛋白酶抑制劑（PMSF）作陽性和陰性對照，樣品不經(jīng)過預(yù)熱處理直接在凝膠上加樣；4℃，50 V下電泳5 h，電泳液為甘氨酸緩沖液；電泳結(jié)束后，將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫45 min×2，去除凝膠中的SDS，然后用漂洗液漂洗20 min×2，以上各步均在4°C進行；將凝膠置于孵育液中37°C孵育42 h，使得蛋白酶活化；孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色3 h，及脫色液A、B、C分別脫色0.5 h、1 h、2 h，直至顯示出藍色背景下的透亮帶；掃入凝膠成像系統(tǒng)進行圖像分析，明膠酶活性用光密度值（OD值）重復(fù)3次；此凝膠經(jīng)成像并以反轉(zhuǎn)模式打印，使酶解活性表現(xiàn)為白色背景上的黑色條帶，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)讀取條帶面積和灰度。條帶酶解量＝條帶面積×（條帶灰度－背景灰度），以“比活”（比活＝酶解量／樣品蛋白濃度，單位為灰度面積×g／L）反映酶的含量。

2 結(jié) 果

2.1 DAO活性變化 見圖1。

圖1 實驗結(jié)束時DAO活性

2.2 小腸黏膜組織MMP－9、TIMP－1 mRNA表達變化 RT－PCR結(jié)果顯示：CPB組MMP－9 mRNA表達水平（2.26±0.19）較 N組（0.28±0.02）和SH組（0.34±0.04）明顯增加（P＜0.01），見圖2；CPB組TIMP－1 mRNA表達水平（0.46±0.07）與N組（0.33±0.05）和SH組（0.41±0.03）無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

圖2 實驗結(jié)束時小腸黏膜組織MMP－9 mRNA表達變化

圖3 實驗結(jié)束時小腸黏膜組織TIMP－1mRNA表達變化

2.3 小腸黏膜組織MMP－9、TIMP－1蛋白表達Western blot結(jié)果顯示，CPB后大鼠小腸黏膜MMP－9蛋白表達顯著高于SH組和N組（P＜0.01）；三組之間TIMP－1蛋白表達無明顯差異（P＞0.05），見圖4和圖5。這一結(jié)果與mRNA水平的結(jié)果相一致。

圖4 實驗結(jié)束時小腸黏膜組織MMP－9蛋白表達變化

圖5 實驗結(jié)束時小腸黏膜組織TIMP－1蛋白表達變化

2.4 小腸黏膜組織MMP明膠分解活性的改變 凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果顯示：CPB組小腸黏膜組織中MMP－9、MMP－2活性與SH和N組比較，均顯著增強（P＜0.01）；并與MMP－9／TIMP－1變化相一致，見圖6。

圖6 實驗結(jié)束時小腸黏膜組織MMP明膠分解活性變化

2.5 小腸黏膜MMP－9活性變化與血漿DAO活性的相關(guān)性 線性回歸及相關(guān)分析結(jié)果顯示：CPB后腸黏膜組織MMP－9活性和血漿DAO活性呈顯著正相關(guān)（r＝0.821，P＜0.01，t＝6.112），見圖7。

圖7 實驗結(jié)束時小腸黏膜組織MMP－9活性變化與血漿DAO活性的相關(guān)性

3 討 論

研究證實，CPB過程可以造成腸屏障功能的損害，這種損害在CPB后腸源性感染和SIRS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［2－3］。但是目前對于這種損害的機制缺乏深入系統(tǒng)的研究。腸黏膜屏障的重要基礎(chǔ)是腸上皮細胞和基底膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性和穩(wěn)定性。腸黏膜ECM主要有腸黏膜上皮基底膜和間質(zhì)性基質(zhì)組成。基底膜的主要成分是層粘連蛋白（LN）和Ⅳ型膠原；基底膜之下的間質(zhì)性ECM則富含Ⅰ、Ⅲ型膠原，纖維粘連蛋白和多種糖蛋白等。MMPs是一組鋅離子和鈣離子依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶，是降解ECM的主要酶系。TIMPs是MMPs的內(nèi)源性特異性組織抑制劑。正常情況下組織MMPs和TIMPs處于動態(tài)平衡狀態(tài)。有觀點認為：腸黏膜損傷之后的愈合與重構(gòu)需要MMPs／TIMPs動態(tài)平衡發(fā)生改變使得任何壞死組織降解和基質(zhì)重建［5］。因此，MMPs在小腸黏膜損傷后愈合重構(gòu)中可能起重要作用。臨床研究表明CPB可引起血清中MMP－9水平升高［8］。本研究通過觀察CPB過程中腸源性MMPs／TIMPs系統(tǒng)變化情況，分析探討其與腸屏障功能的關(guān)系。

前期研究表明CPB后大鼠小腸黏膜ECM各成分如LN、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原含量下降、并且與血漿DAO活性呈顯著的負相關(guān)。證實CPB后腸黏膜ECM的破壞可導(dǎo)致腸屏障功能損害［9］。MMPs是降解間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原和基底膜LN、Ⅳ型膠原等成分的主要酶系。正常小腸組織中MMPs／TIMPs的動態(tài)平衡狀態(tài)參與ECM的正常代謝與更新過程。TIMPs是組織MMPs活性的重要的內(nèi)源性抑制劑，TIMPs以1：1摩爾比例與MMPs形成復(fù)合物，阻斷MMPs與底物的結(jié)合，從而直接降低MMPs的生物學(xué)活性，其中TIMP－1主要對MMP－9有抑制作用。MMP－9是又稱明膠酶B，主要來源于炎癥細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等，對明膠、膠原片段和纖維粘連蛋白等ECM均有降解作用［10］。本實驗結(jié)果顯示，CPB后小腸黏膜組織MMP－9基因表達和蛋白合成明顯增加，明膠酶譜法證實黏膜組織明膠酶MMP－9、MMP－2的明膠分解活性顯著增強，TIMP－1蛋白表達水平無明顯改變，MMP－9／TIMP－1平衡狀態(tài)破壞，有利于MMP－9、MMP－2持續(xù)激活，參與ECM降解、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和腸屏障功能障礙過程。由此推測CPB后腸黏膜ECM含量下降是通過膠原降解增加而不是合成減少來實現(xiàn)的。本研究顯示CPB后小腸黏膜MMP－9表達上調(diào)及其酶活性增加與血漿DAO活性顯著正相關(guān)，說明MMP－9的激活在CPB后小腸黏膜損害和功能障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

綜上所述，筆者認為采取相應(yīng)措施抑制MMP－9的表達和活化程度，對于改善CPB后腸屏障功能，減輕全身炎癥反應(yīng)，降低手術(shù)并發(fā)癥和改善臨床效果均具有重要意義。調(diào)控MMPs活性有可能成為CPB過程中腸屏障功能保護的新靶點。

［1］ Basson MD.Invited research review：cell－matrix interaction in the gut epithetlium［J］.Surgery，2003，133（3）：263－267.

［2］ 商宏偉，肖穎彬，陳林，等.體外循環(huán)對大鼠腸黏膜屏障功能的影響［J］.中華胸心血管外科雜志，2005，21（2）：108－110.

［3］ Grootjans J，Lenaerts K，Derikx JP，et al.Human intestinal is?chemia－reperfusion－induced inflammation characterized：experi?ences from a new translational model［J］.Am J pathol，2010，176（5）：2283－2291.

［4］ 商宏偉，孫盛斌，肖穎彬，等.大鼠體外循環(huán)后血漿二胺氧化酶與小腸黏膜基質(zhì)蛋白變化的相關(guān)性研究 ［J］.中國體外循環(huán)雜志，2013，11（2）：111－115.

［5］ Garg P，Vijay－Kumar M，Wang L，et al.Matrix metalloprotein?ase－9－mediated tissue injury overrides the protective effect of ma?trix metalloproteinase－2 during colitis［J］.Am J Physiol Gastroi?ntest Liver Physiol，2009，296（2）：G175－184.

［6］ 商宏偉，肖穎彬，劉梅，等.大鼠非經(jīng)胸體外循環(huán)模型的建立［J］.中華實驗外科雜志，2005，22（3）：370－371

［7］ 黎君友，于燕，郝軍，等.分光光度法測定血和小腸組織二胺氧化酶活性［J］.氨基酸和生物資源，1996，18（4）：28－30.

［8］ Chen H，Inocencio R，Alam HB，et al.Differential expression of ex?tracellular matrix remodeling genes in rats model of hemorrhagic shock and resuscitation［J］.J Surg Res，2005，123（2）：235－244.

［9］ Marson BP，Lacchini R，Belo V，et al.Functional matrix metal?loproteinase（MMP－9）genetic variants modify the effects of he?modialysis on circulating MMP－9 levels［J］.Clin Chim Acta，2012，414：46－51.

［10］ Helmersson－Karlqvist J，Akerfeldt T，Gunningberg L，et al.Ser?um MMP－9 and TIMP－1 concentrations and MMP－9 activity during surgery－induced inflammation in humans［J］.Clin Chem Lab Med，2012，50（6）：1115－1119.

Expression of matrix metalloproteinase－9 and tissue inhibitor of metalloprotein?ase－1 in gut mucosa and its relationship to intestinal barrier function in rats af?ter cardiopulmonary bypass

Shang Hong－wei，Li Lan，Sun Sheng－bin，Xiao Ying－bin，Liu Mei
Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，PLA 254th Hospital，Tianjin300142，China

Objective To explore the expression of matrix metalloproteinase－9 and tissue inhibitor of metalloproteinase－1（MMP－9／TIMP－1）in gut mucosa and its relationship to intestinal barrier function in rats after cardiopulmonary bypass（CPB）.Methods CPB model in rats was established.40 SD rats were randomly divided into CPB group（n＝20）and sham－operation（SH）group（n＝20），another 10 SD rats were taken as normal control（N）group.The serum diamine oxidase（DAO）activity was measured with spectrophotometry.The changes of mRNA and protein expression of MMP－9，TIMP－1 in the intestinal mucosa were detected by RT－PCR and Western blot respectively.The changes of MMP－9 activity were detected by Gelatin Zymography.Statistical analysis was performed by using software SPSS 16.0.Results The plasma DAO activity in CPB group（1.817±0.359 U／ml）was significantly high?er than those in SH group and N group（P＝0.018），and the expression of MMP－9 mRNA in intestinal mucosa detected by RT－PCR was enhanced more significantly than those in the other two groups.Meanwhile no significant difference was observed in expression of TIMP－1 mRNA in three groups.Expression of MMP－9 protein in intestinal mucosa analysed by Western blot was increased more sig?nificantly in CPB group than those in the other two groups，and no significant difference was observed in expression of TIMP－1 protein in three groups.The gelatinlytic activity of MMP－9 and MMP－2 enhanced more significantly in CPB group than those in SH group and N group.The activity of MMP－9 protein in gut mucosa in CPB group was significantly positively correlated with the activity of plasma DAO by linear correlative analysis.Conclusion Unbalance of MMP－9／TIMP－1 caused by the upregulated expression and enhanced activity of MMP－9 in intestinal mucosa after CPB play important role in the pathogenesis of intestinal barrier dysfunction.Regulating of the activity of MMP－9 may be a new target for the pretection of intestinal barrier function during CPB.

Cardiopulmonary bypass；Rats；Matrix metalloproteinases；Intestinal barrier function

2013?12?20）

2014?02?18）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.02.14

300142天津，天津市解放軍第二五四醫(yī)院心胸外科（商宏偉、孫盛斌），麻醉科（李 嵐）；400037重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管外科（肖穎彬、劉 梅）