廖志輝，龍 村，馮正義

·基礎研究·

扎考必利后處理對離體大鼠心臟的保護作用

廖志輝，龍 村，馮正義

目的 觀察內(nèi)向整流鉀離子（IK1）通道激活劑扎考必利在缺血后處理中的作用并探討可能存在的有關機制。方法 24只大鼠離體心臟，隨機分為非缺血組，缺血再灌組和扎考必利后處理組，分別進行灌注Krebs–Henseleit（K－H）液60 min；缺血30 min再灌注K－H液30 min；缺血30 min再灌注含1 μmol／L扎考必利的K－H液5 min后改用不含扎考必利的KH液灌注25 min。記錄心率（HR），左室發(fā)展壓（LVDP），左室內(nèi)壓的最大上升下降速率（±dp／dtmax）等血流動力學數(shù)據(jù)，冠脈流速（CF）和心律失常情況。再灌注結(jié)束后測量冠脈流出液中的肌鈣蛋白I（cTnI），丙二醛（MDA），總超氧化物歧化酶（TSOD）含量，并用2，3，5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色測心梗面積。結(jié)果 與缺血再灌注組相比，扎考必利后處理組可增加缺血再灌注30 min時的HR，LVDP，＋dp／dtmax，CF，減少心律失常的發(fā)生并減少cTnI及MDA的生成，增加SOD的活性，減少心梗面積。結(jié)論 扎考必利后處理可以有效減輕再灌注后心肌損傷，保護心臟收縮功能和減少心律失常的發(fā)生。

缺血后處理；內(nèi)向整流鉀離子通道；扎考必利；心律失常

心臟手術(shù)后的心功能下降和心律失常與缺血再灌注（ischemic reperfusion，IR）損傷密切相關。缺血后處理能減輕心肌IR損傷，有助于維持心臟正常的結(jié)構(gòu)，功能和電活動［1－2］。扎考必利是選擇性的內(nèi)向整流鉀離子（IK1）通道受體激動劑，許多研究表明其在抗心律失常和心肌保護方面具有重要的意義［3－4］。本實驗旨在觀察利用扎考必利（Zacopride）進行缺血后處理對心臟保護的效果。

1 材料與方法

本實驗設計實施符合動物倫理的相關規(guī)定并通過阜外醫(yī)院倫理委員會審批。

1.1 動物 雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠24只，體重250～300 g，由阜外醫(yī)院動物中心提供。

1.2 藥物及相關溶液 Krebs－Henseleit（K－H）液由阜外醫(yī)院病理中心配制，其成分為（mmol／L）：葡萄糖 11.0，NaCl 118.5，KCl4.75，MgSO41.19，KH2PO41.18，NaHCO325.0，CaCl21.4；扎考必利（Zacopride，Cat.No.1795，Tocris Bioscience，Bristol，UK）；2，3，5－氯三苯四唑（2，3，5－Triphenyltetrazoli?um chloride，TTC，Sigma）。

1.3 主要設備 Langendorff恒壓灌注裝置；血流動力學及心電監(jiān)測設備（AD Instruments）；純水機（Millipore Milli－Q Biocel France）；pH測定儀（Orion 818）；恒溫水浴箱（北京東方儀器廠）。

1.4 實驗方法

1.4.1 Langedorff離體心臟模型的建立 50 mg／kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，1 000 U／kg肝素經(jīng)股靜脈注射抗凝。迅速取出大鼠心臟，置于4℃K－H液中輕輕擠壓數(shù)次，去除心腔內(nèi)殘余血液，從主動脈斷端置入Langendorff灌注針頭深度2～3 mm，通過4＃外科縫線固定主動脈根部于灌注針頭。灌注時，灌注液均采用恒溫水浴箱加熱到37℃，并用95%O2－5% CO2飽和10 min以上，并始終保持灌注液面至心尖的高度為100 cm，以維持100 cm H2O恒壓灌注。

1.4.2 實驗分組 24只大鼠（n＝8）心臟經(jīng)K－H液灌注20 min平衡后隨機分為非缺血組（NI組）：KH液持續(xù)灌注60 min；缺血再灌注組（I／R組）：持續(xù)全心缺血30 min后，用K－H液再灌注30 min；扎考必利后處理組（ZP組）：持續(xù)缺血30 min后，再灌注含1 μmol／L扎考必利的K－H液5 min之后改用不含扎考必利的K－H液灌注25 min。

1.5 觀測指標

1.5.1 血流動力學 觀測左室發(fā)展壓（LVDP），左室內(nèi)壓的最大上升下降速率（±dp／dtmax），心率（HR）冠脈流速（CF）。左心耳開孔后，經(jīng)二尖瓣置入測壓球囊并固定，連接測壓裝置（AD Instruments）通過Chart IV軟件進行數(shù)據(jù)采取。

1.5.2 心律失常 通過連接于心尖和心底的電極記錄心電圖，觀察心律失常情況并進行評分。心律失常的判斷按照 Lambeth會議標準，評分則參考Curtis等人的評分規(guī)則，當＜50個室性早搏（VPB）為0分，＞50個室性早搏為1分，1～5次室性心動過速（VT）為2分，＞6次室性心動過速為3分，自發(fā)終止的心室顫動（VF）≤40 s或一次頑固性的心室顫動＞40 s為4分，2～5次頑固性的心室顫動為5分，＞5次頑固性的心室顫動為6分［5］。

1.5.3 CF及冠脈流出液中肌鈣蛋白I（cTnI），丙二醛（MDA），總超氧化物歧化酶（T－SOD） 在平衡期20 min，再灌注開始5 min，10 min，30 min等四個時點，用試管收集30 s的冠脈流出液用來測量容積并計算流速，將平衡期20 min和再灌注30 min的冠脈流出液各1 ml于－80℃凍存（保存期＜1個月）。采用cT?nI試劑盒（Troponin I ELISA.TPI Kit，Washington，USA），MDA和T－SOD試劑盒（南京建成）按照其說明對凍存標本進行cTnI濃度，MDA和T－SOD活性檢測。

1.5.4 心肌梗死面積 每組（n＝5）灌注結(jié)束后，取下心臟置入－20℃冷凍箱中凍存30 min，垂直于心臟縱軸切成5片，置入37℃ 0.1 mol／L的TTC溶液中染色15 min后，拍攝切片正反面照片，灰白色部分為梗死區(qū)，紅色部分為非梗死區(qū)。利用photoshop 11.0軟件對梗死區(qū)進行測量，計算左室心肌梗死面積及其占左室總面積百分比。

1.6 統(tǒng)計分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，三組血流動力學，冠脈流速和冠脈流出液中酶學指標的檢測結(jié)果和心肌梗死面積百分比以均數(shù)±標準差（±s）表示；心律失常數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，故以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。以單因素方差分析兩兩對比組間同一時點差異（多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA），若總體差異顯著，再以t檢驗分析相應兩組間的顯著性差別）。心律失常發(fā)生率采用卡方檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學和CF 各組的HR，±dp／dtmax，LVDP以及CF的基礎值之間無統(tǒng)計學差異。與NI組相比，再灌注的各時點，ZP組與I／R組的HR與NI組相比均顯著降低（P＜0.05）；但ZP組的HR在各時點均高于I／R組。再灌注5 min時，與NI組相比I／R組的LVDP顯著增加（P＜0.05），但在再灌注15 min和30 min后顯著降低（P＜0.05）；而ZP組的LVDP在再灌注5 min時顯著小于I／R組（P＜0.05），在再灌注15 min和30 min后顯著大于I／R組（P＞0.05）。與NI組的±dp／dtmax相比，I／R組與ZP組在各時點均有不同程度下降；與I／R組相比，ZP組各時點的±dp／dtmax均較高，其中ZP組的＋dp／dtmax在15 min和30 min顯著大于I／R組（P＜0.05）。與NI組的CF相比，I／R組與ZP組在各時點均減少；在再灌注30 min時，ZP組顯著大于I／R組（P＜0.05）。見表1。

2.2 心臟冠脈流出液中酶學指標的檢測結(jié)果 三組心肌漏出液的cTnI，MDA和SOD在平衡期無顯著差異，在再灌注30 min時，ZP組的cTnI顯著低于I／R組［（3.28±0.69）ng／L vs.（5.40±0.89）ng／L，P＜0.05］。ZP組的MDA小于I／R組，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。ZP組的T－SOD含量顯著高于I／R組和NI組［（375.50±59.48）ng／L vs.（291.87±41.75）ng／L，（144.87±36.33）ng／L，P＜0.05］。見圖1。

表1 三組心臟在不同時點的血流動力學與冠脈流量（n＝8，±s）

表1 三組心臟在不同時點的血流動力學與冠脈流量（n＝8，±s）

注：與同時點的NI組比較?P＜0.05；同時點的I／R組比較＃P＜0.05。

觀察指標 分組 基礎值再灌注5 min 15 min 30 min HR（bpm） NI組 303±16 319±14 319±17 298±11 I／R組 309±19 93±10? 194±11? 204±15?ZP組 299±11 106±14? 265±17?＃ 265±17?＃LVDP（mm Hg） NI組 122±9 124±14 115±10 114±9 I／R組 118±12 161±6? 97±8? 82±6?ZP組 115±10 131±9＃ 112±9＃ 116±8＃＋dp／dtmax（mm Hg／s） NI組 5 056±415 5 078±178 5 006±210 4 950±247 I／R組 5 143±361 2 902±212? 3 112±96? 2 807±187?ZP組 4 976±233 2 979±231? 3 687±172?＃ 3 824±313?＃－dp／dtmax（mmHg／s） NI組 －3 173±344 －2 950±304 －2 827±286 －2 632±357 I／R組 －3 046±188 －767±158? －1762±124? －1 927±454?ZP組 －3 066±246 －990±88? －2 62±323?＃ －2 190±205 CF（ml／min） NI組 11.9±0.7 11.4±1.6 10.1±0.8 8.9±0.6 I／R組 12.2±1.5 8.8±0.3? 8.1±0.2? 6.8±0.6?ZP組 12.0±2.0 8.9±0.2? 8.5±0.2? 8.2±0.2?＃

圖1 三組冠脈流出液中cTnI、MDA和T－SOD變化

2.3 心律失常 與NI組相比，I／R組與ZP組的VPB持續(xù)時間和VT次數(shù)均顯著增加。但與I／R組相比，ZP組的VPB持續(xù)時間，VT次數(shù)和心律失常評分顯著減?。≒＜0.05），VT和VF的發(fā)生率雖然小于I／R組，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表2。

2.4 心梗面積 I／R組與ZP組的心肌梗死面積均大于NI組，但I／R組增加更為顯著（P＜0.05）。ZP組的心肌梗死面積小于I／R組，但無統(tǒng)計學差異［（19±3）%vs.（28±8）%，P＞0.05］。見圖2。

3 討 論

大量研究表明，心肌缺血后處理可以減輕心肌缺血再灌注的損傷。最近，Piao等的研究表明在缺氧發(fā)生時，IK1通道開放增加使心肌細胞的動作電位時間（action potential duration，APD）縮短［6］。而阻斷IK1通道可以消除缺血預處理的心肌保護作用，增加缺血再灌注時的心肌細胞死亡率［7］。這些現(xiàn)象提示，IK1通道在心臟的缺血再灌注損傷中可能發(fā)揮著重要作用。

扎考必利屬苯甲酰胺衍生物，是一種5－羥色胺4（5－HT4）受體激動劑，研究表明多種5－HT受體激動劑都對心肌電流存在不同程度影響，其中扎考必利主要是通過蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）等途徑特異性的激活心肌細胞的IK1通道［8－9］。本研究假設通過扎考必利后處理，特異性激活IK1通道，可以通過縮短APD起到抗再灌注損傷和心律失常等作用［10］。

與Gong等人的實驗所采取的缺血策略相似，本實驗采用的缺血／再灌注時間為30 min缺血／30 min再灌注模型［11］。本實驗的結(jié)果表明，利用扎考必利后處理可以增加再灌注時心率，這與Zaritsky等的研究所發(fā)現(xiàn)抑制IK1電流可以降低心率的結(jié)果相一致，其研究認為心率的增加可能與縮短動作電位時程及QT間期有關［12］。在本實驗中通過血流動力學監(jiān)測觀察到，再灌注5 min時扎考必利后處理組的LVDP顯著小于I／R組，但±dp／dtmax及HR均大于I／R組，這提示扎考必利后處理可以減少再灌注早期過度的心肌收縮，并使再灌注心臟保持較好的興奮性。雖然并不知道其具體的原因，但猜測可能與縮短APD減少了再灌注早期的鈣內(nèi)流引起的鈣超載和心肌的過度收縮有關［13］。扎考必利后處理組在再灌注期間的冠脈流速顯著高于I／R組，其機制可能與IK1通道在冠脈血管內(nèi)皮細胞的表達上調(diào)產(chǎn)生的擴張血管作用有關［14］。通過檢測冠脈流出液中三種酶的含量發(fā)現(xiàn)，扎考必利后處理可以減少脂質(zhì)過氧化物MDA的產(chǎn)生，增加SOD的活性。提示扎考必利后處理可能通過減少脂質(zhì)過氧化而發(fā)揮保護作用。有研究表明激活IK1通道后，再灌注期間細胞內(nèi)鉀離子濃度減小，有助于細胞內(nèi)的鈉離子濃度升高導致鈉鈣交換減少，從而減少細胞內(nèi)鈣超載［15］。而鈣超載是引起脂質(zhì)過氧化的重要因素之一。據(jù)此，筆者推測IK1通道激活，可能與減少細胞內(nèi)鈣超載而產(chǎn)生的抗氧化作用有關。但與本實驗結(jié)果不同的是，Campo等發(fā)現(xiàn)再灌注期間大鼠心臟的SOD較缺血前顯著降低，這可能是其采取不同的缺血模型所引起的差異。他們的實驗采用1 h的大鼠在體左冠狀動脈結(jié)扎和6 h時的再灌注，且測量的SOD活性來源于心肌組織，因此，并不能排除血液、神經(jīng)和體液等的影響［16］。而Shuvaev等實驗表明缺血時間以及血液中的白細胞水平，對SOD水平均存在較大的影響［17］。本實驗中采用離體心臟缺血模型，受神經(jīng)體液及白細胞的影響較少，這可能是造成本實驗的結(jié)果與Campo等在實驗中所觀察到的再灌注引起SOD低于基礎值的實驗結(jié)果不一致的原因之一。

表2 再灌注期間三組心臟的心律失常情況［n＝8；數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示］

圖2 三組灌注結(jié)束后的心梗面積

在心律失常方面，缺血再灌注所導致的心律失常與氧自由基增加，鈣超載，外向鉀電流減少所引起的APD延長所導致的早后除極以及跨壁復極離散度增加有關［18］，激活IK1通道可以顯著縮短APD，減少早后除極的發(fā)生。本實驗中，ZP組與I／R相比總體評分優(yōu)于I／R組，ZP組的室性早搏和室性心動過速的持續(xù)時間顯著小于I／R。說明扎考必利在缺血再灌注時具有顯著的抗心律失常作用，這可能對再灌注早期維持正常的心輸出量具有重要的意義。

另外，通過cAMP－PKA信號途徑的促進核因子κB（NF－κB）的活化，減少炎性因子基因轉(zhuǎn)錄是一條重要的心肌保護途徑［19］。而扎考必利主要是通過激活PKA產(chǎn)生的IK1通道開放作用。因此，扎考必利是否存在PKA依賴的抗炎作用？還需要進一步的研究。另外有研究表明心肌5－HT4受體介導了心肌的正性變力作用，但其表達在出生后逐漸退化，而心衰時被重新激活［20］，這與扎考必利的抗心律失常作用是否存在關系，需要更多的實驗證實。ZP組的心肌梗死面積小于I／R組，但差異并不顯著，這可能與本實驗選取的觀測終點的時程較短，缺血再灌注過程引起的很多變化可能還沒有充分表現(xiàn)出來，各組心肌梗死的現(xiàn)象可能不夠充分有關。

通過本實驗證明，扎考必利后處理可顯著減少缺血再灌注引起的心肌損傷。這種保護作用的機制，可能與IK1通道激活后，縮短APD，增加心率，減少惡性心律失常的發(fā)生和抗氧化作用有關。但具體的機制和途徑還需要進一步的研究。

［1］ Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physi?ol，2003，285（2）：H579－588.

［2］ Ovize M，Baxter GF，DiLisa F，et al.Postconditioning and pro?tection from reperfusion injury：where do we stand？Position paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the Eu?ropean Society of Cardiology［J］.Cardiovasc Res，2010，87：406－423.

［3］ Liu QH，Li XL，Xu YW，et al.A novel discovery of IK1 channel agonist：zacopride selectively enhances IK1 current and suppresses triggered arrhythmias in the rat［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2012，59（1）：37－48.

［4］ Wu B，Long C，Hei F，et al.The protective effect of St.Thomas cardioplegia enriched with zacopride on the isolated rat heart［J］.Artificial Organs，2013，37（1）：E44－50.

［5］ Curtis MJ，Walker MJ.Quantification of arrhythmias using scoring systems：an examination of seven scores in an in vivo model of re?gional myocardial ischaemia［J］.Cardiovasc Res，1988，22（9）：656－665.

［6］ Piao L，Li J，McLerie M，et al.Cardiac IK1 underlies early ac?tion potential shortening during hypoxia in the mouse heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，43（1）：27－38

［7］ Diaz RJ，Zobel C，Cho HC，et al.Selective inhibition of inward rectifier K＋channels（Kir2.1 or Kir2.2）abolishes protection by ischemic preconditioning in rabbit ventricular cardiomyocytes［J］.Circ Res，2004，95（3）：325－332.

［8］ Fakler B，Brandle U，Glowatzki E，et al.Kir2.1 inward rectifier K＋channels are regulated independently by protein kinases and ATP hydrolysis［J］.Neuron，1994，13（6）：1413－1420.

［9］ 劉清華，許言午，吳博威.Zacopride增強心肌內(nèi)向整流鉀電流（IK1）效應的受體和信號轉(zhuǎn)導通路 ［J］.中國病理生理雜志，2012，28（1）.6－10.

［10］ Liu QH，Li XL，Xu YW，et al.A novel discovery of IK1 channel agonist：zacopride selectively enhances IK1 current and suppresses triggered arrhythmias in the rat［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2012，59（1）：37－48.

［11］ Gong JS，Yao YT，F(xiàn)ang NX，et al.Sevoflurane postconditioning attenuates reperfusion－induced ventricular arrhythmias in isolated rat hearts exposed to ischemia／reperfusion injury［J］.Mol Biol Rep，2012，39（6）：6417－6425.

［12］ Zaritsky JJ，Redell JB，Tempel BL，et al.The consequences of disrupting cardiac inwardly rectifying K（＋）current（I（K1））as revealed by the targeted deletion of the murine Kir2.1 and Kir2.2 genes［J］.J Physiol，2001，533（Pt 3）：697－710.

［13］ Pott C，Ren X，Tran DX，et al.Mechanism of shortened action potential duration in Na＋－Ca2＋exchanger knockout mice［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292（2）：C968－973

［14］ Forsyth SE，Hoger A，Hoger JH.Molecular cloning and expression of a bovine endothelial inward rectifier potassium channel［J］.FEBS lett，1997，409（2）：277－282.

［15］ Weisser－Thomas J，Piacentino V 3rd，Gaughan JP，et al.Calci?um entry via Na／Ca exchange during the action potential directly contributes to contraction of failing human ventricular myocytes［J］.Cardiovasc Res，2003，57（4）：974－85.

［16］ Campo GM，Squadrito F，Campo S，et al.Beneficial effect of rax?ofelast，an hydrophilic vitamin E analogue，in the rat heart after ischemia and reperfusion injury［J］.J Mol Cell Cardiol，1998，30（8）：1493－503.

［17］ Shuvaev VV，Han J，Tliba S，et al.Anti－Inflammatory Effect of Targeted Delivery of SOD to Endothelium：Mechanism，Synergism with NO Donors and Protective Effects In Vitro and In Vivo［J］.PloS one，2013，8（10）：e77002.

［18］ Mugelli A，Cerbai E，Barbieri M，et al.Cellular electrophysiolog?ical aspects of myocardial protection［J］.Pharmacol Res，1995，31（3－4）：243－249.

［19］ Yang C，Talukder MA，Varadharaj S，et al.Early ischaemic pre?conditioning requires Akt－and PKA－mediated activation of eNOS via serine1176 phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2013，97（1）：33－43.

［20］ Brattelid T，Qvigstad E，Moltzau LR，et al.The cardiac ventricu?lar 5－HT4 receptor is functional in late foetal development and is reactivated in heart failure［J］.PloS One，2012，7（9）：e45489.

The protection of Zacopride postconditioning against the reperfusion injury in rat hearts

Liao Zhi－h(huán)ui，Long Cun，F(xiàn)eng Zheng－yi
Department of Cardiopulmonary bypass of Cardiovascular Institute and FuWai Hospital，Beijing 100037，China Corresponding author：Feng Zheng－yi，Email：fwzyfeng＠gmail.com

Objective To observe the effect of zacopride，an inward rectifier potassium（IK1）channel agonist，in the post?conditioning against myocardial ischemia reperfusion injury and to explore its mechanisms.Methods 24 isolated lagendorff rat hearts were randomly divided into non－ischemia group（NI group，n＝8），ischemia／reperfusion group（IR group，n＝8）and zacopride post?conditioning group（ZP group，n＝8）.Krebs－Henseleit（K－H）buffer was perfused for 60 min in NI group.In IR group，after a peri?od of 30 min ischemia，K－H buffer was perfused for 30 min.While in the ZP group，after a period of 30 min ischemia，K－H buffer containing 1 μmol／L zacopride was persued for 5 min，and then a period of 25 min normal K－H buffer perfusion was followed.Hemo?dynamic data of three groups including the heart rate（HR），left ventricular developed pressure（LVDP），maximum positive and nega?tive derivative of left ventricular pressure（±dp／dtmax）and coronary flow（CF）were recorded.Coronary effluent was collected to measure the concentration of cardiac troponin I（cTnI），malondialdehyde（MDA）and total superoxide dismutase（T－SOD）.Myocar?dial infarction size was measured by 2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride（TTC）staining.Results Compared with that in the IR group，cardiac hemodynamic data of LVDP，＋dp／dtmaxand CF in the ZP group was improved significantly.Compared whith that in the other two goups，the incidence of arrhythmia，the generation of cTnI and MDA，and myocardial infarction size reduced significantly，and the SOD activity enhanced apparently in the ZP group.Conclusion Zacopride postconditioning can effectively reduce myocardial injury of ischemia reperfusion by increasing cardiac function and reducing the incidence of arrhythmia.

Ischemia postconditioning；Inward rectifier potassium channel；Zacopride；Arrhythmia

2013?12?28）

2014?02?12）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.02.16

100037北京，中國醫(yī)學科學院阜外心血管病醫(yī)院體外循環(huán)中心

馮正義，Email，fwzyfeng＠gmail.com