陳元淵, 陳紅巖, 盧大儒

復旦大學生命科學院, 遺傳學國家重點實驗室, 上海 200433

SNARE蛋白調控細胞自噬的分子機制

陳元淵, 陳紅巖, 盧大儒

復旦大學生命科學院, 遺傳學國家重點實驗室, 上海 200433

細胞自噬是細胞在面對內外部環(huán)境壓力的情況下, 為了自身的穩(wěn)定而采取的一種降解內部及外來入侵物質的機制。SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)假說指出SNARE蛋白在細胞物質運輸以及特異性膜融合過程中具有重要作用, 揭示了細胞正常生理活動有序進行的分子機制。由于細胞自噬涉及從自噬體的形成到自噬體溶酶體的融合等諸多膜融合的過程, 因此, 文章對近年來 SNARE蛋白在調控細胞自噬過程的研究進展進行了綜述。

細胞自噬; SNARE假說

細胞自噬(Autophagy)是細胞在面對內外環(huán)境壓力時采取的一種維持自身穩(wěn)定的機制, SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)假說是關于細胞在物質運輸過程中特異性膜融合的理論, 該假說認為在細胞內的運輸小泡及靶膜上都存在著 SNARE蛋白, 它們互相識別結合, 為物質的運輸提供了特異性, 保障了細胞正常生理活動的有序進行。由于細胞自噬的發(fā)生也需要物質的運輸以及膜與膜融合等過程的協(xié)同作用,因此, SNARE蛋白在其中也發(fā)揮了不可或缺的重要作用[1]。本文就近年來SNARE蛋白在調控細胞自噬方面的研究進展進行了綜述。

1 細胞自噬

細胞自噬是真核生物細胞內部降解大分子蛋白、細胞器以及外來病原微生物的重要途徑。根據(jù)降解底物的類型、底物運輸?shù)姆绞胶驼{控機制的不同, 細胞自噬分為巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)以 及 分 子 伴 侶 介 導 的 自 噬(Chaperone-mediated autophagy)。其中, 巨自噬是目前研究最為廣泛的細胞自噬類型, 通過該途徑降解的底物種類也是最多的, 因此在通常情況下, 細胞自噬指的就是巨自噬(下同)類型。

細胞自噬是一個多步驟、受多種蛋白調控的復雜過程。當細胞自噬的程序被啟動時, 細胞會在其內部合成一種被稱為自噬體(Autophagosome)的雙層膜結構, 自噬體會將細胞內部待消化的物質完全包裹吞噬后送入溶酶體 (動物)或液泡(酵母和植物)中進行降解并得以循環(huán)利用。通過這一過程, 細胞自噬不僅可以為細胞在饑餓的環(huán)境中提供必需的營養(yǎng)物質, 還可以及時清除擾亂細胞內穩(wěn)態(tài)的危險因素,使細胞能夠更好地適應外部環(huán)境的變化, 抵御外來物質的入侵, 從而維持正常的生理功能[2～4]。研究表明,細胞自噬功能的紊亂可以導致多種疾病的發(fā)生[5～8]。

細胞自噬的進程包括從自噬體胞膜的形成、延伸與成熟到自噬體與溶酶體融合等步驟, 這些階段涉及許多膜與膜融合的過程, 因此研究者推測對細胞膜融合過程的調控也可以影響細胞自噬的發(fā)生發(fā)展, 從而改變細胞對外界環(huán)境的適應能力。

2 SNARE假說

SNARE假說是2013年諾貝爾生理醫(yī)學獎得主James Rothman與同事根據(jù)他們對動物細胞融合的研究而提出的理論。動物細胞融合需要一種可溶性的細胞質蛋白——N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein, NSF)以及其他幾種可溶性的 NSF附著蛋白(Soluble NSF attachment protein, SNAP)。由于 NSF/SNAP 能夠介導不同類型小泡的融合, 說明它沒有特異性。據(jù)此Rothman 等提出一種假設：膜融合的特異性是由另外的膜蛋白提供的, 把這種蛋白稱為 SNAP受體蛋白(SNAP receptor), 或稱為SNARE, 這種蛋白可以作為膜融合時 SNAP的附著點。按照Rothman的SNARE假說, 每一種運輸小泡都有一個特殊的 V-SNARE (Vesicle-SNAP receptor)標志, 能夠同適當靶膜上的T-SNARE (Target-SNAP receptor) 標志相互作用。然而在某些情況下, 細胞內也會發(fā)生同種類型的膜融合作用, 為了避免混淆, 根據(jù)SNARE蛋白殘基端一段高度保守的區(qū)域, 又可分為 R-SNARE(Argininecontaining SNARE)與Q-SNARE(Glutamine-containing SNARE)。一種運輸小泡在沒有找到合適的靶位點之前可能會與幾種不同的膜位點進行暫時性地接觸,然而這種接觸是不穩(wěn)定的, 只有找到真正的靶位點后才會形成穩(wěn)定的結構。換言之, 在不同的小泡上存在不同的 V-SNARE, 它們能識別靶膜上特異的T-SNARE 并與之結合, 以此保證運輸小泡到達正確的目的地[2,3,9]。目前已發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種SNARE蛋白參與胞內各個細胞器以及細胞間的物質信號傳遞過程。

3 SNARE蛋白對細胞自噬的調控

3.1 自噬前體形成的調控

自噬體的形成是細胞自噬過程的第一步, 盡管已發(fā)現(xiàn)有多達18種Atg蛋白參與了自噬體的形成[10],但是關于自噬體的起源目前仍無定論[11]。已有的研究指出[12], 哺乳動物中 Atg蛋白家族成員以有序的方式先后聚集到細胞內質網(wǎng)附近的區(qū)域并形成自噬前體結構(Pre-autophagosomal structure, PAS)。而作為核心Atg蛋白家族成員中的跨膜蛋白, Atg9調控其他Atg蛋白的招募過程并且在PAS附近形成Atg9小泡幫助PAS的形成[13,14]。同時, Atg9小泡通過與PAS的膜融合可以為自噬體外膜的形成提供必需的脂類物質[15]。SNARE假說作為重要的膜融合機制在此過程中發(fā)揮了重要的調控作用。Nair等[16]在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中發(fā)現(xiàn), Q/t-SNARE蛋白Sso1/2和Sec9可以有效地促進Atg9小泡與PAS的膜融合過程以及Atg8蛋白的招募。在Sso1/2和Sec9的突變體中, Atg9與PAS的熒光信號共定位比率分別下降43%和36%, 而Atg8與PAS的熒光信號甚至無法共定位。此外, Ykt6蛋白與 Q/t-SNARE型的Tlg2蛋白和R/v-SNARE型的Sec22蛋白共同組成復合物, 調控Atg9小泡的轉運與自噬體的形成。由此可見, SNARE蛋白調控了Atg9小泡與PAS的膜融合, 相關SNARE蛋白的突變可以影響PAS的形成從而導致細胞自噬過程的阻滯。

3.2 吞噬泡成熟的調控

在細胞自噬體形成的早期, 由 Atg12、Atg5以及Atg16L1組成的蛋白復合物Atg16L1-Atg12-Atg5結合在早期自噬體的外表面, 幫助其成熟, 直到自噬體完全形成后釋放至胞漿中。因此, 結合有Atg16L1-Atg12-Atg5復合物的自噬體由于還沒有完全成熟, 故被稱為吞噬泡[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18], SNARE蛋白VAMP7以及它的互作蛋白Syntaxin7、Syntaxin8和Vti1b與吞噬泡上的Atg16L1和Atg5共定位, 參與調控自噬體的形成。上述蛋白的缺失可以顯著抑制自噬體的形成與 Atg16L1小泡的融合并限制Atg16L1小泡的擴張。研究還進一步證實, VAMP7蛋白的Hrb與Longin結構域作為其關鍵的功能區(qū)域,可以促進其與網(wǎng)格蛋白的接頭蛋白 AP-2相互作用,從而參與網(wǎng)格蛋白介導的細胞內吞過程, 幫助VAMP7蛋白從細胞膜表面運輸至胞漿內參與調控細胞自噬。上述兩個結構域的缺失可以阻斷VAMP7蛋白的功能從而抑制細胞自噬體的形成并減小Atg16L1小泡的體積。由此可見, SNARE蛋白VAMP7及其互作蛋白可以通過Atg16L1來調控吞噬泡的成熟, 進而改變細胞內的自噬水平。

3.3 早期自噬體形成的調控

目前, 除了與自噬體形成相關的信號蛋白的具體調控機制受到人們的關注之外, 對于自噬體早期形成時的亞細胞定位也逐漸成為研究熱點。已有許多證據(jù)顯示, 在哺乳動物細胞中, 自噬體早期的形成定位在細胞內質網(wǎng)與線粒體交會的區(qū)域：在細胞自噬發(fā)生初期, 自噬相關蛋白ULK1與Atg14L在內質網(wǎng)附近都有表達[12,19], 對細胞自噬進行誘導之后可以促使 Atg14L信號聚集在內質網(wǎng)線粒體交會區(qū)域[20,21]; 此外, 另一個自噬體標簽蛋白Atg5也和線粒體相關的內質網(wǎng)膜(Mitochondria-associated ER membrane, MAM)標簽蛋白VDAC1在胞漿內的定位相互接近[21]。然而, Atg14L蛋白通過什么機制聚集到自噬前體上參與自噬體的形成呢？研究發(fā)現(xiàn)[21]在通過饑餓的方法誘導細胞自噬后, SNARE蛋白Stx17與Atg14L相似, 也大量聚集在內質網(wǎng)線粒體的交會區(qū)域, 并且Stx17與Atg14L有很強的相互作用。當Stx17表達被抑制以后, Atg14L無法在內質網(wǎng)線粒體交會區(qū)域聚集, 同時Atg5蛋白也始終定位在自噬體膜上(自噬體完全形成之后, Atg5蛋白會從自噬體膜上解離下來)。上述證據(jù)暗示, SNARE蛋白Stx17是自噬體形成的必需因子, 參與自噬相關蛋白Atg14L定位至自噬體形成區(qū)域的過程, 調控早期自噬體的形成。

3.4 自噬溶酶體形成的調控

SNARE蛋白Stx17在細胞自噬體早期形成方面具有重要的調控, 最近發(fā)現(xiàn)其在自噬溶酶體形成過程中也具有重要作用。Itakura等[22]研究發(fā)現(xiàn), 在通過饑餓的方法誘導細胞自噬后, Stx17蛋白能夠轉運至自噬體上, 并且通過與溶酶體上的 SNARE蛋白VAMP8以及另外一個SNARE蛋白Snap-29相互作用, 促進自噬體與溶酶體的融合, 完成細胞自噬的過程。抑制Stx17的表達后, 細胞內自噬體不斷積聚但自噬溶酶體的數(shù)量卻沒有因此增加, 這意味著自噬體與溶酶體的融合被阻斷。研究進一步指出, Stx17蛋白的C端有一個獨特的結構域, 使其形成一個發(fā)夾狀的結構。當自噬體與溶酶體進行融合時,這個定位于自噬體外膜上的“發(fā)夾”結構域可以與VAMP8和Snap-29蛋白互作, 促進自噬體與溶酶體的融合, 從而調控細胞自噬的過程。

近年來的研究證據(jù)顯示, 可能有不止一對的SNARE蛋白參與細胞自噬體與溶酶體的融合。Furuta等發(fā)現(xiàn)[23,24], 位于自噬體上的 SNARE蛋白Vti1b也可以與溶酶體上的SNARE蛋白VAMP8結合, 調控自噬體與溶酶體的融合過程。同時抑制Vti1b與 VAMP8的表達可以阻斷自噬體標簽蛋白LC3與溶酶體標簽蛋白LAMP1熒光信號的共定位。上述兩個研究暗示在自噬溶酶體的形成過程中, 可能同時需要多對 SNARE互作蛋白為自噬體膜與溶酶體膜的融合提供特異性, 但是 SNARE蛋白VAMP8與Stx17及Vti1b三者究竟是一種什么樣的互作關系呢？Itakura等[22]發(fā)現(xiàn), Stx17蛋白既與VAMP8蛋白結合, 又與Vti1b蛋白結合。分別抑制VAMP8或Vti1b的表達后, 發(fā)現(xiàn)在VAMP8抑制組的細胞內, 自噬體標簽蛋白LC3的熒光信號顯著高于對照組, 表明細胞內部的自噬體無法與溶酶體結合, 從而導致其數(shù)量不斷增加并最終發(fā)生自噬流(Autophagic flux)的阻斷; 而Vti1b抑制組的細胞則沒有出現(xiàn)上述現(xiàn)象。由此證實, 在自噬溶酶體的形成過程, Stx17與VAMP8這一對SNARE蛋白的作用對細胞自噬溶酶體的形成是必不可少的, Vti1b與VAMP8的作用可能是一種促進作用。

綜上所述, 作為細胞重要的物質信號傳輸轉運系統(tǒng), SNARE蛋白在細胞自噬體的早期發(fā)生、形成與成熟以及最后與溶酶體的融合過程中均起著不可替代的調控作用, 相關蛋白的缺失可以導致不可逆轉的自噬功能缺陷, 對細胞的正常生理功能產(chǎn)生重大的影響。

4 展 望

細胞自噬作為細胞面對環(huán)境壓力下重要的生存機制目前已經(jīng)得到了廣泛的研究, 同時也有越來越多的報道指出, 細胞自噬在某些情況下還是促使細胞程序性死亡的重要手段。這些證據(jù)暗示, SNARE蛋白作為一種調控細胞自噬的重要機制, 在細胞生死決策中的作用可能也不可或缺。目前, 包括腫瘤研究在內的疾病研究中, 細胞自噬本身受到了人們的廣泛關注與研究, 然而對于調控細胞自噬的SNARE蛋白在疾病的發(fā)生發(fā)展、藥物耐受等過程中的作用卻報道較少。除了細胞自噬, SNARE蛋白在葡萄糖的轉運、血管生成以及細胞轉移等方面的調控作用已有研究報道。SNARE蛋白的生物學功能是重要并且多樣的, 機制還有待進一步闡明, 為了能夠進一步揭示 SNARE蛋白在疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展、放化療耐受以及臨床預后中的作用與機制,全面地了解 SNARE蛋白在細胞中的具體作用, 未來還需要從不同的角度, 從基礎和臨床研究兩方面更多地開展針對性研究, 積累更加全面和豐富的證據(jù)和數(shù)據(jù), 并積極探索針對 SNARE蛋白藥物靶點設計開發(fā)新藥的研究。

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(責任編委: 周榮家)

Molecular mechanisms of SNARE proteins in regulating autophagy

Yuanyuan Chen, Hongyan Chen, Daru Lu

State Key Laboratory of Genetics, School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200433, China

Autophagy is a self-protective mechanism that degrades inner and outer invaded substances to sustain self-maintenance. SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) hypothesis suggests important roles of SNARE proteins in the cellular activities of substance transport and specific membrane fusion, unveiling the molecular mechanisms of normal and physiological activities within a cell. Since autophagy involves membrane fusions from the birth of autophagosomes to the formation of autolysosomes, we review recent research progress on the roles of SNARE proteins in regulating autophagy.

autophagy; SNARE hypothesis

2013-12-09;

2014-01-14

國家自然科學基金項目(編號：81372706, 81372235 資助)

陳元淵, 博士研究生, 研究方向：分子遺傳學。E-mail: xoocharles@163.com

盧大儒, 博士, 教授, 研究方向：遺傳學。E-mail: drlu@fudan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0547

時間: 2014-5-4 15:26:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140504.1527.006.html