劉一倩 易欣欣

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

新鮮蔬果中食源性致病細(xì)菌研究進(jìn)展

劉一倩 易欣欣

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

食用新鮮蔬果引起的食源性疾病快速增長(zhǎng)，惡性事件時(shí)有發(fā)生。關(guān)注于國(guó)外與蔬果有關(guān)的致病細(xì)菌的研究進(jìn)展，主要介紹了蔬果的微生物性質(zhì)調(diào)查，分析了細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群和致病細(xì)菌的分布規(guī)律；重要的致病細(xì)菌污染來(lái)源及影響污染率的原因；致病細(xì)菌在蔬果中的存活規(guī)律，并對(duì)重要因素進(jìn)行排序；介紹了去除致病細(xì)菌通用方法和具有潛在應(yīng)用價(jià)值的方式方法；致病細(xì)菌在蔬果中的附著方式，著重介紹了大腸桿菌O157：H7的3種附著方式。另外，還對(duì)相關(guān)的研究趨勢(shì)提出了看法。

新鮮蔬果 食源性疾病 致病細(xì)菌 大腸桿菌O157：H7 沙門氏菌

隨著人們健康觀念的加強(qiáng)，新鮮蔬菜水果的消費(fèi)量不斷增加。有研究表明，多吃蔬菜水果可以減少罹患慢性非傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)［1］。FAO和WHO的專家建議，每天最少攝入400 g新鮮蔬果，以預(yù)防冠心病、肥胖、糖尿病、癌癥等其他疾?。?］。但在消費(fèi)量增加的同時(shí)，新鮮蔬果引起的微生物性食源性疾病也快速增長(zhǎng)。20世紀(jì)70年代，在美國(guó)，蔬果引起的微生物食物中毒不足1%，到20世紀(jì)90年代上升為6%；在英國(guó)，1993年-1998年為6.4%，而1999年-2000年上升為10.1%；歐洲24個(gè)國(guó)家自2000年到2005年共報(bào)道了14 000起微生物食源性疾病案例；2000年-2005 年，澳大利亞的新鮮果蔬引起的微生物食源性疾病占全部食源性疾病的4%［3］。由于新鮮蔬果引起的食源性疾病快速增長(zhǎng)，歐美各國(guó)都非常重視，開(kāi)展了大量的調(diào)查和研究工作，并采取了嚴(yán)格的衛(wèi)生預(yù)防措施。但2011年歐美依然爆發(fā)了葫蘆巴發(fā)芽種子攜帶的大腸桿菌O104：H4和香瓜攜帶的單核細(xì)胞增生李斯特菌的嚴(yán)重事件，分別導(dǎo)致39人和27人死亡。這表明要完全控制新鮮蔬果引起的微生物食源性疾病還有很長(zhǎng)的路

要走。在中國(guó)，新鮮蔬果引起的致病微生物食源性疾病鮮有報(bào)道。這可能是由于以下原因：（1）我國(guó)的食物中毒的漏報(bào)率高，美國(guó)2005年-2007年平均每年報(bào)道1 103起食物中毒，22 340人次，每起平均21個(gè)人。我國(guó)2006年-2010年平均每年報(bào)到405起，12 584人次，每起平均31人。（2）中國(guó)人生食蔬果尤其是蔬菜的品種和比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美人。（3）我國(guó)蔬果生產(chǎn)中所使用的化學(xué)品比例較高，一定程度上抑制了病原菌的生長(zhǎng)、繁殖。（4）許多較輕的食物中毒現(xiàn)象被忽視。（5）我們的監(jiān)控系統(tǒng)還不完善，覆蓋率較低。

食品安全問(wèn)題越來(lái)越為廣大民眾所關(guān)注，中國(guó)食品安全評(píng)估中心認(rèn)為我國(guó)的食品安全排位前三的風(fēng)險(xiǎn)分別為：（1）致病微生物引起的食源性疾??；（2）農(nóng)藥等化學(xué)性污染；（3）人為添加非法添加劑。

隨著人們生活習(xí)慣的改變，中國(guó)人生食蔬菜的比例不斷增加，未雨綢繆，加強(qiáng)新鮮蔬果相關(guān)致病細(xì)菌的調(diào)查與研究將是我們面臨的關(guān)乎食品安全的又一個(gè)重要問(wèn)題。本文將簡(jiǎn)要介紹國(guó)外有關(guān)新鮮蔬果的致病細(xì)菌的研究進(jìn)展情況。

1 分布調(diào)查

從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，針對(duì)新鮮蔬果所攜帶的微生物種類、數(shù)量、性質(zhì)進(jìn)行的研究越來(lái)越多，以明確食用新鮮果蔬引起的食源性疾病的原因。這些研究一般檢測(cè)市場(chǎng)銷售或農(nóng)田中生長(zhǎng)的新鮮蔬果中微生物的性質(zhì)，檢測(cè)指標(biāo)大多為細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、致病細(xì)菌（主要為大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌，也有一些研究涉及其他致病細(xì)菌，如單核細(xì)胞增生李斯特菌，空腸彎曲桿菌等）。

細(xì)菌總數(shù)來(lái)源為新鮮蔬果中的正常區(qū)系微生物和外界污染菌，一般來(lái)說(shuō)總菌數(shù)越大，外界污染的程度越高，蔬果攜帶致病細(xì)菌的幾率越大。蔬菜中總菌數(shù)高于水果，其中發(fā)芽種子類最高（7-9 logCFU/g），生菜、菠菜等葉類蔬菜亦比較高（5-8 logCFU/g），而蘋果、柑橘等水果總菌數(shù)較低（1-5 logCFU/g）［4-6］。大腸菌群不屬于蔬果的正常區(qū)系微生物，它們一般來(lái)源于直接或間接的人及動(dòng)物糞便的污染，許多國(guó)家以其作為致病細(xì)菌的指示菌。此外，果蔬品種也是影響大腸菌群數(shù)量的重大因素，與總菌數(shù)一樣，一般規(guī)律也是發(fā)芽種子、鮮切菜、葉菜及水果，數(shù)量總體在（0.1-7 logCFU/g）之間［4-6］。

發(fā)芽種子發(fā)芽的溫度一般就是嗜中溫細(xì)菌快速生長(zhǎng)的溫度，發(fā)芽過(guò)程中的水分和營(yíng)養(yǎng)也較適合細(xì)菌的生長(zhǎng)，許多研究都發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌總數(shù)與大腸菌群數(shù)量很高，就是因?yàn)榘l(fā)芽的同時(shí)，也給了細(xì)菌適宜的繁殖環(huán)境。生菜、菠菜等葉類蔬菜由于其相對(duì)較大的表面積和褶皺使其更易于細(xì)菌的污染和附著，因此其細(xì)菌數(shù)與大腸菌群數(shù)也相對(duì)較高，而蘋果等水果由于其表面光滑，不易于細(xì)菌附著和污染，其細(xì)菌總數(shù)與大腸菌群數(shù)就相對(duì)較少了。

通過(guò)新鮮蔬果引起食源性疾病的病原體包括病毒、寄生蟲和致病細(xì)菌，其占比例分別為病毒約20%、寄生蟲約16%、致病細(xì)菌超過(guò)60%［7］。致病細(xì)菌所占比例最高。歐美國(guó)家新鮮蔬果相關(guān)的食源性疾病爆發(fā)的比例不斷提高，其中相關(guān)度最高的致病細(xì)菌就是大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌，但美國(guó)和加拿大在較大范圍內(nèi)的檢測(cè)工作中，這兩種致病細(xì)菌檢出的比例是比較低的，在加拿大，從1 856個(gè)蔬果樣品中只有兩個(gè)樣品為沙門氏菌陽(yáng)性［8，9］。同樣，美國(guó)FDA在2006年檢測(cè)了7 646個(gè)蔬果樣品，沙門氏菌的檢出率僅為0.04%，而大腸桿菌O157：H7則沒(méi)有檢出［5］。2007年在英國(guó)、愛(ài)爾蘭、德國(guó)和荷蘭的大規(guī)模檢測(cè)檢測(cè)中沙門氏菌的檢出率從0.1%-2.3%［10］。但在馬來(lái)西亞，112個(gè)蔬果樣品中有40個(gè)檢出沙門氏菌，檢出率為35%［11］；但同一地區(qū)的新加坡在125個(gè)樣品中，大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌均未檢出［4］。筆者檢測(cè)了北京地區(qū)115個(gè)蔬菜樣品，上述兩種致病細(xì)菌也未檢出。種植方式、水源衛(wèi)生、環(huán)境條件、生產(chǎn)加工過(guò)程微生物控制等多種因素可能是引起這種反差的主要原因。

2 污染來(lái)源和影響原因

2.1 來(lái)源于動(dòng)物的污染

動(dòng)物是大多數(shù)致病細(xì)菌的最初來(lái)源，致病細(xì)菌會(huì)隨動(dòng)物的糞便排泄出去，而動(dòng)物的糞便又是有機(jī)肥的主要原料。研究表明，許多蔬菜都可以通過(guò)施于土壤中的含菌糞肥而攜帶大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌［12，13］。蔬果生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)采取措施防止動(dòng)物進(jìn)入，更要防止未經(jīng)處理的動(dòng)物糞便污染以保障

蔬果產(chǎn)品的安全。另外，蔬果還可以由野生動(dòng)物或昆蟲而攜帶致病細(xì)菌［14，15］。野生動(dòng)物本身就是病原菌的攜帶者，昆蟲由于其活動(dòng)規(guī)律，是病原菌傳播的重要途徑之一。

2.2 來(lái)源于水的污染

蔬果在采收前后都離不開(kāi)水，用被污染的水灌溉會(huì)對(duì)其造成污染，Mitra等［16］的研究表明通過(guò)被大腸桿菌O157：H7污染的土壤里種植的菠菜未檢出大腸桿菌O157：H7，但通過(guò)污染的水灌溉卻檢出了大腸桿菌O157：H7。因此，在蔬果生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)灌溉用水的監(jiān)測(cè)。灌溉方式也會(huì)影響污染率，直接作用于蔬果本身的灌溉方式其污染率要高于溝灌等方式［17］。另外，暴雨等引起的水災(zāi)也會(huì)導(dǎo)致蔬果的污染［14］，水淹過(guò)的蔬果生食非常危險(xiǎn)。歐美國(guó)家的新鮮蔬果大多經(jīng)過(guò)統(tǒng)一的加工處理，以即食食品方式提供給消費(fèi)者。采后污染來(lái)源可通過(guò)清洗水、包裝材料、加工工具、加工環(huán)境及人員等途徑污染蔬果，其中最主要的是通過(guò)清洗水［18］。FDA和USDA在新鮮蔬果食品減少微生物危害指導(dǎo)中要求用于可食部分的灌溉水和清洗水要達(dá)到飲用水的標(biāo)準(zhǔn)。加工過(guò)程中的切割形成的切面，由于失去表皮保護(hù)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲出，非常利于致病細(xì)菌的污染和繁殖。Kroupitski 等［19］和Ukuku 等［20］在鮮切生菜和鮮切瓜類的試驗(yàn)都說(shuō)明了這點(diǎn)。

2.3 來(lái)源于土壤的污染

土壤是微生物的大本營(yíng)，很多致病細(xì)菌都能在土壤中存活較長(zhǎng)的時(shí)間。土壤中致病細(xì)菌的來(lái)源一般是農(nóng)業(yè)投入品（水、肥和種子等）和被污染的作物殘骸，環(huán)境因素有時(shí)也會(huì)給土壤帶來(lái)致病微生物。土壤環(huán)境、外界溫度等是影響微生物在蔬果中存活的重要因素，較高的溫濕度有利于致病細(xì)菌在蔬果中存活與生長(zhǎng)［21］。本實(shí)驗(yàn)室研究表明，北京地區(qū)生菜和芹菜在冬季細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群明顯低于其他季節(jié)（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。此外，土壤類型也影響致病細(xì)菌在蔬果上的存活，有人認(rèn)為黏土中的蔬果污染率高于沙土［22］，也有研究的結(jié)論正好相反［23］。確切的結(jié)論目前還沒(méi)有，致病細(xì)菌種類及果蔬品種不同都是影響的因素，在不同的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中，致病細(xì)菌的表現(xiàn)也是多種多樣的。

2.4 致病細(xì)菌種類和蔬果品種對(duì)污染的影響

多數(shù)研究認(rèn)為沙門氏菌在蔬果中存活的時(shí)間長(zhǎng)于大腸桿菌O157：H7［24］。Islam 等［25］在歐芹生產(chǎn)中的研究表明大腸桿菌O157：H7 和沙門氏菌的存活期分別為177 d和231 d［26］。致病細(xì)菌豐度也影響污染程度，分別用含106/g、105/g和104/g沙門氏菌肥料施用于菠菜，14 d后僅在106/g的處理中檢出沙門氏菌invA基因［27］。蔬果的品種污染發(fā)生率和致病細(xì)菌存活率也有較大關(guān)聯(lián)度。例如，沙門氏菌在菜苣上發(fā)生污染的幾率大于生菜［28］。大腸桿菌O157：H7與沙門氏菌在歐芹中存活的時(shí)間長(zhǎng)于生菜中［25］。而大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌在生菜中污染的數(shù)量要高于在菠菜中［29］。研究蔬果與致病細(xì)菌的對(duì)應(yīng)關(guān)系，找出高危因子，采取針對(duì)措施，對(duì)保障蔬果產(chǎn)品安全十分有意義。

3 致病細(xì)菌在蔬果中存活的規(guī)律

由于致病細(xì)菌在蔬果中的檢出率較低，研究主要使用的方法是人工接種一定數(shù)量的致病細(xì)菌到蔬果上，再在不同的條件下觀察接入致病細(xì)菌數(shù)量變化的規(guī)律。一般影響致病細(xì)菌數(shù)量變化的因素主要有溫度、品種、原有菌群及包裝貯存方式等。

最顯著的影響因素是溫度，一般4℃或4℃以下，能有效防止大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌在蔬果上的增殖［30］。對(duì)于大多數(shù)蔬果4℃是一個(gè)分界點(diǎn)，4℃以下一般在7-14 d內(nèi)致病細(xì)菌不會(huì)增長(zhǎng)或略有下降，而4℃以上尤其是8℃以上致病細(xì)菌通常會(huì)有不同程度的增長(zhǎng)［31］。在15℃下間存貯7 d和14 d后大腸桿菌O157：H7在生菜上分別增加2.0和3.0 logCFU/g［32］。因此，保持即食蔬果采收后的有效冷鏈對(duì)防止致病細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖十分有效。致病細(xì)菌在蔬果中的存活由其代謝能力決定，而代謝能力的強(qiáng)弱由其自身能力和外界環(huán)境條件決定。Joshua等［33］研究了鮮切芹菜在4℃、12℃和22℃條件下，不同包裝及切割狀況下大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌的存活規(guī)律發(fā)現(xiàn)，除溫度外不同的致病細(xì)菌、貯存方式和包裝方法及芹菜中的原始菌群數(shù)量都對(duì)致病細(xì)菌本身的存活有影響。因此，決定致病細(xì)菌在蔬果中數(shù)量的原因排序如下：存貯溫度、存貯時(shí)間、蔬果品種、致病細(xì)菌種類、

包裝形式、加工形式及原始菌群等。這方面的研究存在的問(wèn)題是同一致病細(xì)菌由不同研究者在不同蔬果（甚至相同蔬果）中研究得到的結(jié)果不盡相同。這可能是由于同一蔬果本身品種差異與致病細(xì)菌的相互關(guān)系不盡一致，這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。另外，研究工作進(jìn)行的時(shí)間、采用的方法條件和微生物計(jì)數(shù)的誤差等都可能給這項(xiàng)工作帶來(lái)不同的結(jié)果。

4 蔬果中致病細(xì)菌去除方法

新鮮蔬果的加工企業(yè)常使用含氯溶液對(duì)產(chǎn)品消毒，氯濃度一般在50-200 ppm，處理時(shí)間不超過(guò)2 min。研究表明，用含氯溶液可以有效減少蔬果所攜帶的微生物數(shù)量［34］，但氯殘留有潛在的致癌和致畸作用。同時(shí)，氯還能被一些有機(jī)物失活，從而降低其殺菌功能。目前，許多研究工作集中在尋找、比較出更有效、無(wú)殘留的殺菌方法，如酸化電離水，二氧化氯和酸化亞氯酸鹽也可作為氯的替代物，二氧化氯不參加氯化（Chlorination）反應(yīng)，不產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物。Rodger等［35］發(fā)現(xiàn)，二氧化氯水溶液可以減少5 logCFU/g以上的大腸桿菌O157：H7和單核細(xì)胞增生李斯特菌（人為接種在生菜、胡蘿卜和蘋果上）。Stopforth等［36］報(bào)道酸化的亞氯酸鈉在生菜上減少大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌大于3 logCFU/g。還有一些工作是關(guān)于過(guò)氧化氫、有機(jī)酸、臭氧作為消毒劑的使用，但其應(yīng)用都存在各種限制。噬菌體是專門寄生于細(xì)菌的病毒，基于其殺菌的專一性和高效性，同樣為新鮮蔬果的殺菌消毒提供了一種可能的途徑。研究表明，在許多蔬果品種中使用特異性噬菌體都能使大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌有效降低，利用噬菌體與植物精油共同作用于生菜中的大腸桿菌O157：H7效果更佳［37］。Puapermpoonsiri 等［38］利用可生物降解的聚酯微球體技術(shù)，使噬菌體活性損失大量減少，使噬菌體殺菌的方法更具實(shí)用性。理想的方法應(yīng)該符合殺菌效率高、營(yíng)養(yǎng)損失少、不產(chǎn)生有害殘留、使用方便、環(huán)境友好的要求。 上述各種消毒殺菌的方法各有優(yōu)勢(shì)，但也都有所缺陷，還達(dá)不到理想要求。表1對(duì)各種方法的優(yōu)劣進(jìn)行了比較。

5 附著方式

附著是致病細(xì)菌能夠在蔬果表面及內(nèi)部存活進(jìn)而形成群落的必要前提。許多致病細(xì)菌附著的方式并不是單一的，大腸桿菌O157：H7有3種附著機(jī)制。一種是可以通過(guò)Curli菌毛黏附，與非致病大腸桿菌相比，大腸桿菌O157：H7 附著在蔬果表面的能力非常強(qiáng)，將其編碼Curli菌毛的操縱子（csg-A-G）轉(zhuǎn)入大腸桿菌K12也可使其變得能夠黏附，但若敲除大腸桿菌O157：H7的Curli菌毛基因依然具有較強(qiáng)的附著能力，說(shuō)明大腸桿菌O157：H7的附著力不僅依靠Curli菌毛［39］；第二種是通過(guò)細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS），T3SS廣泛存在于革蘭陰性致病細(xì)菌，是由多種蛋白分子復(fù)合體構(gòu)成的跨膜蛋白輸出裝置，病原菌可以通過(guò)T3SS注射裝置（Injectisome）將細(xì)菌分泌蛋白（效應(yīng)蛋白）注入宿主細(xì)胞，研究表明，敲除大腸桿菌O157：H7 T3SS的EspA基因或EscN（ATPase）都可使E. coliO157失去附著能力［40，41］。此外，Xicohten-Cortes等［40］發(fā)現(xiàn)鞭毛與黏附有關(guān)，敲除編碼鞭毛蛋白的flic基因能減低大腸桿菌O157：H7 的黏附水平。由此可見(jiàn)，大腸桿菌O157：H7在蔬果上的附著和群落化是由多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果。同樣，沙門氏菌的附著方式也不是單一的，Curli菌毛、O抗原莢膜和形成細(xì)胞基質(zhì)（Cellular matrix）都有助于其附著在蔬果表面［42］。大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌在蔬果中引起的食源性疾病遠(yuǎn)高于其他致病細(xì)菌，就是因其具有多種附著方式使其在不同蔬果中生長(zhǎng)、繁殖形成群落，進(jìn)而導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生。

表1 各種除菌方式的比較

6 結(jié)語(yǔ)

蔬菜水果是人們?nèi)粘Ｉ畋夭豢缮俚氖称?。由于它們攜帶的致病細(xì)菌引起食源性疾病不斷增加，國(guó)外也進(jìn)行了相應(yīng)的廣泛研究，但仍不能完全有效阻止此類事件的發(fā)生。今后的研究趨勢(shì)可能會(huì)集中在以下方面：（1）食源性疾病的偶發(fā)性與產(chǎn)品大規(guī)

模檢測(cè)及污染來(lái)源的相關(guān)性研究；（2）不同蔬果（尤其是易引發(fā)微生物性食源性疾病的品種）與致病細(xì)菌之間關(guān)系的研究，以了解不同蔬果品種與不同致病細(xì)菌間的關(guān)聯(lián)度，從而確定高危品種，同一種蔬果不同品種間也可能存在被致病細(xì)菌污染差異的情況；（3）高效、無(wú)殘留、環(huán)境友好的除菌方法的研究與應(yīng)用；（4）蔬果自身抵抗致病細(xì)菌（免疫力）的研究，此方面研究已在擬南芥中展開(kāi)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Progress in Study of Foodborne Pathogens in Fresh Fruit and Vegetables

Liu Yiqian Yi Xinxin
（Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue，Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing 102206）

The number of foodborne illness events caused by eating fresh vegetables and fruit grows rapidly, malignant events have occurred sometimes. This article focuses on the research progress of pathogens associated with vegetables and fruit abroad, vegetables and fruit were introduced microbial quality investigation, analyzed the distribution rule of total bacterial count, coliform group and pathogenic bacteria, the important pathogenic bacteria pollution sources and the influence factors of the pollution rate, the survival rule of pathogenic bacteria in vegetables and fruit, the important factors are sorted. About the methods of removing pathogenic bacteria, this paper introduces the general methods and the methods having potential application value；On the attachments of pathogenic bacteria to vegetables and fruit, this article introduces three adhesions of E. coli O157：H7. In addition, views of study trends are put forward.

Fresh vegetables and fruit Foodborne diseases Pathogenic bacteria Escherichia coli O157: H7 Salmonella

2013-10-14

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資金資助（blvt-16）

劉一倩，女，講師，研究方向：食品微生物學(xué)；E-mail：liuyi143@163.com

易欣欣，男，碩士，講師，研究方向：致病微生物與蔬菜產(chǎn)品安全；E-mail：yixinxin2008@163.com