孫繼國韓增葉葛喜珍田平芳

（1.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029；2.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京 100023）

基于重組大腸桿菌無細胞體系生產(chǎn)吡咯喹啉醌

孫繼國1韓增葉1葛喜珍2田平芳1

（1.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029；2.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京 100023）

采用無細胞體系生產(chǎn)吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）。首先將肺炎克雷伯氏菌PQQ基因簇pqqABCDEF置于半乳糖苷酶啟動子之下，構建表達載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選獲得重組大腸桿菌。制備重組菌的細胞勻漿，體外反應后測定PQQ產(chǎn)量。結果顯示，與活體重組菌相比，無細胞體系的PQQ產(chǎn)量提高約30%，表明胞內(nèi)存在PQQ合成的限速反應，而無細胞體系可解除此限速反應。

大腸桿菌 無細胞體系 吡咯喹啉醌 限速反應

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是不同于煙酰胺嘌呤核苷酸（NAD/NADP）和黃素核苷酸（FMN/FAD）的一種新型輔酶，被歸類為B族維生素［1］。PQQ分子中含有參與氧化還原反應的鄰醌類結構，可作為輔因子參與脫氫、氧化、水合和脫羧等反應［2］。迄今，PQQ主要發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陰性細菌，如肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）等［3，4］。大腸桿菌（Escherichia coli）不能合成PQQ，但能合成以PQQ為輔因子的酶蛋白［5，6］。肺炎克雷伯氏菌的PQQ合成基因為線性排列的基因簇pqqABCDEF，包括6個閱讀框［7］，pqqA負責前體的合成，其余基因產(chǎn)物參與催化或轉(zhuǎn)運。

在大腸桿菌中已成功表達乙酸鈣不動桿菌和肺炎克雷伯氏菌的PQQ基因簇，并檢測到PQQ的合成［8］。前者的PQQ合成量較低，后者培養(yǎng)基中的PQQ產(chǎn)量達到230 nmol/L，推測是在胞質(zhì)合成PQQ，然后運輸釋放到培養(yǎng)基中。乙酸鈣不動桿菌的PQQ分泌能力較弱。作為輔因子，PQQ參與多種反應，較難在胞內(nèi)高度積累，推測是因為存在限速步驟。無細胞體系（cell-free system）是基于不完整細胞或完全不依賴細胞生產(chǎn)目標產(chǎn)物的方法，常用于研究多酶反應的限速步驟，或直接用酶進行體外催化［9］。

利用T7啟動子在大腸桿菌中過表達葡萄糖酸桿菌的pqqABCED閱讀框，但不能大量合成PQQ［10］，推測胞內(nèi)存在PQQ合成的限速步驟。本研究用無細胞體系驗證限速步驟，旨在探索體外用細胞勻漿合成PQQ。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)條件 肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniaeDSM 2026），大腸桿菌E. coliDH5α及E. coliBL21，以及攜帶PQQ基因簇的表達質(zhì)粒pETPQQ由本實驗室保存。大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌的通用培養(yǎng)基為Luria-Bertani（LB），重組大腸桿菌的培養(yǎng)基為高糖M9培養(yǎng)基，其葡萄糖濃度為1.5%（W/V）。上述兩菌的培養(yǎng)溫度分別為37℃和30℃（肺炎克雷伯氏菌提供PQQ基因簇），轉(zhuǎn)速為200 r/min，抗生素為硫酸卡那霉素50 mg/L。

1.1.2 主要試劑 PrimeStar聚合酶、ExTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司；PQQ標品購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的構建 以pET28a質(zhì)粒為骨架，選擇BglII和EcoR I為上下游酶切位點，將其自身的T7啟動子更換為半乳糖苷酶啟動子pLAC（以本實驗室構建的pET-PQQ為對照，PQQ基因簇含自身原始啟動子）。設計引物如表1所示。PCR克隆pUC19中的lac啟動子（用ExTaq聚合酶，PCR參數(shù)：95℃5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min）。基于T7啟動子前面的BglII位點和多克隆位點的EcoR I位點，將T7啟動子更換為lac啟動子，得到重組載體pET-pLAC。將去掉原始啟動子的肺炎克雷伯氏菌PQQ基因簇pqqABCDEF插入其下游。具體方法：以肺炎克雷伯氏菌基因組DNA為模板，PCR擴增5.5 kb的pqqABCDEF基因簇。根據(jù)GenBank報道序列設計引物。使用PrimerStar聚合酶，PCR參數(shù)：98℃ 3 min；98℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 5 min，共30個循環(huán)。用EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切pET-pLAC，將5.5 kb的PQQ基因簇插入pET-pLAC質(zhì)粒，構建由pLAC調(diào)控的pqq基因簇表達質(zhì)粒pET-pLAC-PQQ。

表1 試驗所用引物

1.2.2 重組菌培養(yǎng)條件 以LB培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，高糖M9培養(yǎng)基（1.5%葡萄糖）為發(fā)酵培養(yǎng)基。大腸桿菌在37℃下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 r/min。用種子培養(yǎng)基活化重組菌，按1%菌量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基。當重組菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）的OD600值為0.6時加入誘導劑IPTG，使其終濃度為1 mmol/L。以E. coli（pET-PQQ）為對照，培養(yǎng)72 h，測定PQQ產(chǎn)量（卡那霉素終濃度為50 mg/mL）。

1.2.3 無細胞體系的制備 工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)基過夜活化，按1%菌量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基。當E. coli（pET-pLAC-PQQ）的OD600值為0.6時，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，培養(yǎng)24 h后測OD600。按OD600=1時10 mL菌液量（即OD600×V=10），5 000 r/min離心10 min，加入裂解緩沖液，超聲破碎細胞，收集培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)基，測OD600后按相同菌量離心，棄上清，用pH7.0的PBS重懸，再次離心，棄上清，以洗去殘余培養(yǎng)基，離心后加入15 mL（即OD600×V值的1.5倍）細胞破碎緩沖液，超聲破碎，4℃下經(jīng)5 000 r/min離心10 min，取上清，避光密閉條件下30℃孵育3 h，測定孵育前后的PQQ產(chǎn)量（非酶法測定）。無細胞體系反應條件：30℃，3 h。用于超聲破碎的緩沖液成分：pH7.0磷酸緩沖液，0.1%巰基乙醇，0.05% PMSF。超聲條件：超聲2 s，間隔3 s，功率80 Hz，50次。

1.2.4 PQQ含量與生長速度測定 PQQ含量用非酶法測定［11］；用比濁法測定600 nm下的菌體吸光度，繪制生長曲線。

2 結果

2.1 含LAC啟動子載體的構建

超表達基因?qū)⒃斐蛇^重的細胞負荷。因質(zhì)粒pET28a攜帶T7強啟動子，故需更換為半乳糖苷酶啟動子（pLAC，來自pUC19質(zhì)粒）。PCR產(chǎn)物經(jīng)電

泳鑒定，符合預期（～500 bp），電泳結果見圖1。測序結果表明啟動子序列完全正確。

圖1 LAC啟動子克隆及載體構建示意圖

2.2 PQQ基因簇的克隆與重組載體構建

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，符合目的條帶大?。ā?.5 kb）。

基于EcoR I和Hind Ⅲ兩個酶切位點，將5.5 kb的PQQ基因簇插入含LAC啟動子的載體，提取質(zhì)粒，酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）表明，不同啟動子的PQQ重組質(zhì)粒構建成功。E. coliDH5α為質(zhì)粒擴增宿主菌，E. coliBL21為表達宿主菌，載體及菌種見表2。

圖2 Lac啟動子載體的構建

表2 菌株及重組質(zhì)粒

2.3 PQQ基因簇的表達

因PQQ基因簇的原始啟動子及半乳糖苷酶啟動子均非強啟動子，且PQQ基因簇本身含有發(fā)卡轉(zhuǎn)錄抑制結構，因此基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生的蛋白較少，從SDS-PAGE難以辨認，故只能從PQQ產(chǎn)量來間接體現(xiàn)基因的表達。

2.4 發(fā)酵液中PQQ產(chǎn)量

工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)基過夜活化，在高糖M9發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，向E. coli（pET-pLAC-PQQ）加入誘導劑IPTG，用非酶法檢測發(fā)酵上清液的PQQ含量。結果（圖3）表明，E. coli（pET-pLAC-PQQ）與E. coli（pET-PQQ）的PQQ產(chǎn)量基本一致，表明這兩種啟動子對PQQ產(chǎn)量無明顯差異。

圖3 兩種重組菌的PQQ產(chǎn)量

2.5 工程菌生長曲線

由生長曲線可知，攜帶PQQ基因的重組菌比對照菌（含空載體pET）提前2 h進入平穩(wěn)期，系因PQQ基因表達導致了代謝負荷。若扣除該代謝負荷，PQQ的合成促進了菌體生長。進入平穩(wěn)期后，重組菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）的生物量略低于其他菌，可能是添加IPTG造成了細胞毒性?？傮w來看，重組

菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）與其他菌的生物量基本持平，表明生成的PQQ至少沒有抑制大腸桿菌的生長繁殖（圖4）。

圖4 重組大腸桿菌生長曲線

2.6 無細胞體系培養(yǎng)

2.6.1 無細胞體系破碎條件的確定 細胞破碎條件是影響胞液中酶活的關鍵因素，因此對常用4種破碎條件進行選擇，經(jīng)過無細胞反應體系后確定條件1為最佳破碎條件（圖5）。

圖5 細胞破碎條件

2.6.2 無細胞體系孵育條件的確定 因缺乏無細胞體系孵育條件的相關研究，因此研究了PQQ體外反應最佳條件。最終確定反應條件為30℃，避光密封孵育3 h（圖6）。

2.6.3 工程菌無細胞體系反應 按照上述方法對工程菌進行無細胞體系反應，反應結束后測定PQQ產(chǎn)量。

測定結果（圖7）表明，細胞破碎前后對照菌的PQQ產(chǎn)量沒有變化，但重組菌E. coli（pET-pLACPQQ）的PQQ產(chǎn)量卻提高了約30%，表明重組菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）的細胞內(nèi)存在瓶頸反應，從而限制了PQQ的合成。細胞破碎后，其PQQ產(chǎn)量明顯增加，表明限速步驟被解除，PQQ合成反應得以繼續(xù)。

圖6 無細胞體系反應條件

圖7 重組菌無細胞體系孵育前后的PQQ產(chǎn)量

3 討論

無細胞體系是提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量的重要策略，其本質(zhì)是解除活細胞內(nèi)生化反應的限速步驟［9］。本研究構建了合成PQQ的重組大腸桿菌，結果表明更換啟動子及優(yōu)化培養(yǎng)基未能顯著提高PQQ產(chǎn)量。考慮到限速反應的存在，建立了無細胞體系。與活細胞合成PQQ相比，重組菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）

經(jīng)無細胞體系反應后，其PQQ產(chǎn)量提高約30%，表明胞內(nèi)存在瓶頸反應，無細胞體系可解除此瓶頸。該結果證明了PQQ體外合成的可行性。此外，培養(yǎng)條件、能量與還原力平衡、粗提液成分及酶活性均影響PQQ產(chǎn)量。

本試驗的PQQ增產(chǎn)幅度有待提高，表明細胞粗提物無法達到最優(yōu)效果。若對底物和酶進行純化，對反應條件進行優(yōu)化，并充分考慮能量和還原力等因素，可望進一步提高PQQ產(chǎn)量。由于PQQ生物合成機理尚未完全闡明，通常會采用超表達其基因簇或無細胞體系來提高其產(chǎn)量。由于PQQ是葡萄糖脫氫酶的輔酶，推斷PQQ通過參與葡萄糖代謝而促進細胞生長。結果顯示，PQQ基因的表達導致了代謝負荷，若扣除該代謝負荷，PQQ的合成促進了菌體生長。事實上，有文獻［12］報道PQQ能刺激細胞生長，推斷PQQ與細胞生長之間存在耦合關系。因此，共表達PQQ基因簇和葡萄糖脫氫酶基因可望促進PQQ的積累。此外，由于PQQ參與多種代謝過程以及其合成機制的復雜性，對PQQ生產(chǎn)菌進行大規(guī)?；蚪M改造，然后進行高通量篩選，不失為PQQ高產(chǎn)育菌的有效策略［13］。隨著PQQ合成機理的闡明，其無細胞生產(chǎn)體系也將得以完善。

4 結論

構建了合成PQQ的重組大腸桿菌，結果表明更換啟動子及優(yōu)化培養(yǎng)基未能顯著提高PQQ產(chǎn)量?？紤]到限速反應的存在，建立了無細胞體系。與活細胞合成PQQ相比，重組菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）經(jīng)無細胞體系反應后，其PQQ產(chǎn)量提高約30%，表明胞內(nèi)存在瓶頸反應，無細胞體系可解除此瓶頸。培養(yǎng)條件、能量與還原力平衡、粗提液成分及酶活性均影響PQQ產(chǎn)量。

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（責任編輯 馬鑫）

Exploiting Cell-free System of Recombinant E. coli to Synthesize Pyrroloquinoline Quinone

Sun Jiguo1Han Zengye1Ge Xizhen2Tian Pingfang1
（1. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029；2. College of Biochemical Engineering，Beijing Union University，Beijing 100023）

In this study, cell-free system was developed to overproduce pyrroloquinoline quinone（PQQ）. The PQQ gene cluster from Klebsiella pneumoniae was subcloned into vector harboring lac promoter and a recombinant Escherichia coli was acquired. Subsequently cell homogenate was prepared which showed ～30% increase of PQQ yield compared with in vivo biosynthesis. Not only revealing the presence of intracellular velocity-limiting reaction（s）that retards PQQ biosynthesis, this study also suggests that cell-free system can address this issue. Hence, this study provides basis for further enhancement of PQQ production.

E. coli Cell-free system Pyrroloquinoline quinine Velocity-limiting reaction

2013-11-25

國家自然科學基金項目（21076013），“973”項目（2012CB725200）

孫繼國，男，碩士研究生，研究方向：微生物代謝工程；E-mail：mishiweilan@126.com

田平芳，男，博士，教授，研究方向：微生物基因工程；E-mail：tianpf@mail.buct.edu.cn