陳紅偉李英倫劉娟吳俊偉黃慶洲

（1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，雅安 625014）

抗菌肽的臨床應(yīng)用與內(nèi)源性表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展

陳紅偉1李英倫2劉娟1吳俊偉1黃慶洲1

（1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，雅安 625014）

抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，具有分子量低、熱穩(wěn)定、廣譜的抗菌、抗病毒及抑制腫瘤的生物活性，是動(dòng)植物防御體系的一個(gè)重要組成部分，在機(jī)體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用。但實(shí)踐表明，作為抗生素替代品的抗菌肽的開發(fā)并非易事。針對(duì)近年來抗菌肽研究的熱點(diǎn)，對(duì)抗菌肽的臨床應(yīng)用和表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。

抗菌肽 Ⅲ期臨床試驗(yàn) 基因表達(dá)調(diào)控 開發(fā) 策略

2010年，Lancet Infect Dis雜志報(bào)道的“超級(jí)細(xì)菌”，對(duì)臨床應(yīng)用的絕大多數(shù)抗生素都具有耐藥性，引起了全世界的恐慌，被譽(yù)為“抗生素的替代品”的抗菌肽為人類戰(zhàn)勝耐藥微生物帶來了新的契機(jī)［1］。起初，人們稱抗菌肽為“Antibacterial peptides”，意為“抗細(xì)菌的肽”，中文譯為“抗菌肽”，隨后研究發(fā)現(xiàn)有些“抗菌肽”還可以抗真菌、抗病毒和抗寄生蟲等，故改稱為“Antimicrobial peptides，AMPs”，即“抗微生物的肽”［2］，但在國(guó)內(nèi)“抗菌肽”作為一個(gè)通俗名稱，已被廣泛采用。據(jù)查證，已經(jīng)有2 000多種抗菌肽被發(fā)現(xiàn)，且以很快的速度增長(zhǎng)。這些最新抗菌肽都可以在國(guó)際上權(quán)威的抗菌肽數(shù)據(jù)庫（http：//www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/antimic.html和 http：//aps.unmc.edu/AP /main.html）中查詢，抗菌肽多來于自微生物、植物和動(dòng)物［2，3］。目前，部分抗菌肽已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。本文對(duì)其開發(fā)策略、臨床研究與應(yīng)用和表達(dá)調(diào)控作一綜述。

1 抗菌肽開發(fā)的基本策略

一般而言，抗菌肽可通過以下3種途徑獲得［4］：（1）從生物體內(nèi)直接提取純化；（2）化學(xué)人工合成；（3）采用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗菌肽基因工程菌株。然而由于抗菌肽為體內(nèi)誘導(dǎo)合成，生物體中含量較低，從宿主有機(jī)體中分離抗菌肽的成本極高，并且對(duì)于大多數(shù)抗菌肽而言也不現(xiàn)實(shí)［5］；隨著多肽及蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步闡明和多肽合成技術(shù)的產(chǎn)生，人工合成具有生物活性的肽或肽段為抗菌肽的研究

提供了很大方便，但針對(duì)一些特殊結(jié)構(gòu)的多肽，如人防御素分子中含有3對(duì)二硫鍵，化學(xué)合成的多肽時(shí)難以保證正確配對(duì)，從而影響其生物活性［6］；另外化學(xué)合成的方法同樣存在成本較高的問題，10個(gè)殘基以上多肽的合成很昂貴，限制了抗菌肽的推廣應(yīng)用［4］。

由此可見，采用提取或合成的方法進(jìn)行抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)目前還不現(xiàn)實(shí)，與此相比，基因工程技術(shù)的快速發(fā)展正使得借助細(xì)菌或酵母等表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模制備抗菌肽成為可能［4，5］。但從目前抗菌肽基因工程改良方面來看，還存在一些問題有待解決［7］：第一，抗菌肽在轉(zhuǎn)基因表達(dá)過程中對(duì)蛋白酶較為敏感，如何解決易被分解的問題；第二，如何保持基因工程改造后與天然抗菌肽空間結(jié)構(gòu)一致性的問題；第三，如何采取適當(dāng)工藝提高產(chǎn)品回收率，降低回收成本的問題［7］。

2 抗菌肽的臨床研究與應(yīng)用

一些陽離子抗菌肽已經(jīng)通過詳細(xì)的臨床試驗(yàn)調(diào)查，并完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)［8］。2012年，Andres等［9］對(duì)抗菌肽的臨床研究情況進(jìn)行了報(bào)道，如表1所示。

表1 陽離子抗菌肽的臨床試驗(yàn)階段［9］

雖然，抗菌肽的臨床試驗(yàn)研究已經(jīng)取得了階段性成功，但要大面積地用于臨床還會(huì)遇到很多問題［8］，如免疫排斥反應(yīng)、生理作用的復(fù)雜性、潛在的毒副作用、穩(wěn)定性以及如何有效地降低成本等?？梢酝ㄟ^開展研制各種高效低成本的抗菌肽制備生產(chǎn)系統(tǒng)，包括基因工程方法、人工合成法、天然抗菌肽提取純化等制備方法，以及以天然抗菌肽為母體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到藥物新化合物等［10］，為抗菌肽最終大規(guī)模應(yīng)用于臨床提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。與此同時(shí)，可積極開展如何提高機(jī)體內(nèi)源性抗菌肽表達(dá)的研究，特別是畜禽內(nèi)源性抗菌肽的表達(dá)，這是當(dāng)前實(shí)現(xiàn)抗菌肽推廣應(yīng)用于畜牧業(yè)中經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。

3 抗菌肽內(nèi)源性表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展

如上所述，由于天然抗菌肽的來源非常有限，現(xiàn)階段通過化學(xué)合成或由基因工程重組表達(dá)抗菌肽還存在成本相對(duì)較高、難度大等問題，因此提高內(nèi)源性抗菌肽表達(dá)水平是比較經(jīng)濟(jì)有效的方法［4，11］，尤其是針對(duì)畜牧生產(chǎn)中抗菌肽的推廣和應(yīng)用。主要途徑有：（1）通過遺傳方法選育出具有高抗菌肽表達(dá)水平的品種或品系；（2）通過外源途徑調(diào)控機(jī)體內(nèi)源性抗菌肽表達(dá)，而后者有賴于對(duì)抗菌肽表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入研究［11］。一般認(rèn)為，抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控；（2）mRNA加工、成熟水平上的調(diào)控；（3）翻譯水平上的調(diào)控。

近年來，已有大量的研究報(bào)道了病原微生物誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源抗菌肽的表達(dá)［12-16］，如采用沙門氏菌攻毒，豬抗菌肽PR-39和protegrin基因轉(zhuǎn)錄水平提高［17］，但志賀氏細(xì)菌對(duì)家兔抗菌肽CAP-18的表達(dá)起下調(diào)作用［18］，也有學(xué)者提出如果動(dòng)物感染疾病嚴(yán)

重到一定程度時(shí)，其抗菌肽基因表達(dá)水平可能下降，病情加?。?9］。另外，在通過外源途徑（非病原微生物）調(diào)控機(jī)體內(nèi)源性抗菌肽表達(dá)，從而提高機(jī)體的防御能力方面，已有部分學(xué)者開展了微量養(yǎng)分或中藥對(duì)抗菌肽表達(dá)調(diào)控的研究。

3.1 微量養(yǎng)分對(duì)抗菌肽表達(dá)的影響

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在積極開展諸如維生素、微量元素等微量養(yǎng)分對(duì)動(dòng)物內(nèi)源性抗菌肽表達(dá)的影響研究。2005年，汪以真等［20］報(bào)道仔豬日糧中添加不同形式的鋅源ZnSO4、ZnO、納米ZnO均能提高PR-39mRNA表達(dá)量，其中以高劑量ZnO（3 000 mg/kg）的調(diào)控效果最為顯著，提高量為378.26%。王燕等［21］采用RT-PCR法研究日糧和骨髓細(xì)胞中添加不同濃度牛乳鐵蛋白（bLF）對(duì)仔豬髓源性抗菌肽PMAP-37基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，日糧中添加0.125%和0.25%bLF組分別使PMAP-37基因的表達(dá)提高了109.62%和69.23%，骨髓細(xì)胞中分別添加10、100和1 000 g/mL bLF在3和6 h誘導(dǎo)后均能提高PMAP-37基因表達(dá)趨勢(shì)。趙玉蓉等［22］報(bào)道了斷奶仔豬日糧中添加1.0%谷氨酰胺（Gln）能顯著增加仔豬血清中IL-1β的含量，顯著上調(diào)骨髓和空腸黏膜抗菌肽PR-39 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，分別提高了50.5%和24.0%。Pigeon等［16］采用高鐵飼料喂養(yǎng)或胃腸外途徑給鐵，造成小鼠鐵負(fù)荷增多，小鼠肝細(xì)胞抗菌肽HepcidinmRNA表達(dá)水平顯著增加，并與鐵累積劑量呈正相關(guān)，而機(jī)體內(nèi)缺鐵可使Hepcidin的表達(dá)顯著降低。2007年，Schwab等［23］報(bào)道了丁酸鹽能誘導(dǎo)人腸道抗菌肽LL-37的表達(dá)，并表明丁酸鹽介導(dǎo)的LL-37表達(dá)上調(diào)是受多條信號(hào)通路和VDR、TGF-β1等受體的影響。與此同時(shí)，Raqib等［24］研究證實(shí)，感染志賀氏細(xì)菌后，家兔結(jié)腸發(fā)生潰爛時(shí)其腸道上皮細(xì)胞不能表達(dá)CAP-18抗菌肽，但用丁酸鹽處理后家兔腸道上皮細(xì)胞CAP-18表達(dá)量增加，嚴(yán)重程度減緩以及糞便細(xì)菌數(shù)量也減少。2012年，Campbell等［25］報(bào)道了維生素A、D，膳食組蛋白，丁酸和次膽汁酸對(duì)人抗菌肽Cathelicidins等基因表達(dá)具有調(diào)控作用。黎德兵等［26］研究發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)在飼料中添加2 000 IU/kg的維生素D3可顯著提高黃鱔內(nèi)臟組織中hepcidin基因的表達(dá)量；飼喂周期較長(zhǎng)，飼料中添加500 IU/kg維生素D3可顯著提高h(yuǎn)epcidin基因在黃鱔肝胰臟和頭腎中的表量。

3.2 中藥對(duì)抗菌肽表達(dá)的影響

近年來，部分學(xué)者在中藥對(duì)抗菌肽表達(dá)的影響方面進(jìn)行了大膽的嘗試，為提高機(jī)體內(nèi)源性抗菌肽的表達(dá)水平，同時(shí)也為中藥作用機(jī)理提出新的合理的解釋開辟了新的研究思路。2008年，趙玉蓉等［27］報(bào)道了牛膝多糖能顯著促進(jìn)斷奶仔豬骨髓抗菌PG-1mRNA表達(dá)，且日糧中以0.10%添加量為適宜。趙燕飛等［28］采用白術(shù)微粉對(duì)仔豬抗菌肽PR-39mRNA和Protegrin-1mRNA表達(dá)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，0.5%和1%微米白術(shù)組分別顯著提高了PR-39mRNA表達(dá)量27.86%和58.81%；1%微米白術(shù)組顯著提高了Protegrin-1mRNA 表達(dá)量75.76%，并提出白術(shù)對(duì)這兩種抗菌肽的表達(dá)有調(diào)控作用，可能是通過激活巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等來釋放內(nèi)源性免疫調(diào)控物質(zhì)，如TNFα、interleukins、INF等，進(jìn)一步激活PR-39和Protegrin-1的調(diào)控因子，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。2013年，Guo等［29］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過維生素D受體依賴性途徑誘導(dǎo)抗菌肽cathelicidin基因表達(dá)。

4 展望

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用甚至濫用，抗生素在畜禽產(chǎn)品中的殘留、細(xì)菌耐藥性、過敏反應(yīng)和環(huán)境污染等問題日漸嚴(yán)重，從而引發(fā)了人們對(duì)飼料、食品和環(huán)境安全的極大關(guān)注，迫使人們開始尋找新型抗菌劑［30］。由于抗菌肽具有分子量小、水溶性好、耐熱、對(duì)高等動(dòng)物的正常細(xì)胞幾乎無毒害作用等特點(diǎn)，極有可能成為一種高效、低毒并且無殘留的抗菌、抗病毒和抗癌新藥，近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)抗菌肽類物質(zhì)的研究越來越多，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

如前所述，雖然有不少抗菌肽已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但主要集中在人醫(yī)臨床領(lǐng)域，目前抗菌肽要在畜牧生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，還存在一些瓶頸問題需要解決，首先，天然抗菌蛋白的來源非常有限，分離純化難度大、耗費(fèi)大、收率低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；其次，現(xiàn)階段通過化學(xué)合成或由基因工程重組表達(dá)抗菌肽對(duì)于需要大面積、大劑量使用的經(jīng)濟(jì)

動(dòng)物而言，還存在成本相對(duì)較高、難度大等問題。因此提高動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源性抗菌肽表達(dá)水平是比較經(jīng)濟(jì)有效的方法［10］，如可以通過添加外源性物質(zhì)（微量養(yǎng)分、中藥等）來提高動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源性抗菌肽水平，進(jìn)而提高機(jī)體的防御能力，為最終實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)的“健康養(yǎng)殖”提供新途徑。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Progress on Antimicrobial Peptides’Gene Endogenous Expression Regulation and Clinical Application

Chen Hongwei1Li Yinglun2Liu Juan1Wu Junwei1Huang Qingzhou1
（1. Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460；2. College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）

Antimicrobial peptides are a group of small molecular proteins with antibacterial activities, which are key components of animal and vegetation defense system and play an important role in protecting body from invasion of pathogens. These peptides have many characters such as low molecular weight, thermostability. And they have the wide range of antibacterial, antiviral spectrum and inhibiting growth of tumor cells. However, the development of antimicmbial peptides as antibiotic substitutes is far from easy. The recent warm spots about antimicrobial peptides, especially gene expression regulation and clinical application were reviewed.

Antimicrobial peptides Ⅲ clinical trials Gene expression regulation Development Strategy

2013-09-16

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2012C099），重慶市科委自然科學(xué)基金計(jì)劃資助項(xiàng)目（cstc2012jjA80013）

陳紅偉，男，博士研究生，講師，研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)；E-mail：chw80926@126.com