劉劍 劉君昂 周國(guó)英 李河 楊菁

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004）

響應(yīng)面法優(yōu)化革耳Panus rudis FG-35菌株產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基

劉劍 劉君昂 周國(guó)英 李河 楊菁

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004）

采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，對(duì)革耳Panus rudis FG-35菌株產(chǎn)漆酶的液體培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)基中的最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，最優(yōu)氮源為蛋白胨；Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選出影響漆酶產(chǎn)量的 3 個(gè)重要因素為可溶性淀粉、金屬Ca2+離子和吐溫-40，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，最后利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析，獲得最佳培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉 10.040 4 g/L、蛋白胨 0.2 g/L、K2HPO41.00 g/L、ZnSO4·7H2O 0.008 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CuSO4·7H2O 0.007 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO40.035 g/L、CaCl20.081 6 g/L、VB10.1 g/L、吐溫-40 0.428%。在優(yōu)化后的條件下?lián)u瓶發(fā)酵產(chǎn)漆酶酶活力為263.31 U/mL，與模型預(yù)測(cè)值接近，發(fā)酵產(chǎn)酶量比優(yōu)化前提高1.07倍，同時(shí)優(yōu)化后的發(fā)酵液對(duì)木質(zhì)素降解進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后漆酶對(duì)木質(zhì)素降解率提高了14.34%。

漆酶 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 響應(yīng)面 降解

漆酶是最早被研究的酶類之一。日本學(xué)者Yoshida首次發(fā)現(xiàn)，但研究者對(duì)漆酶了解并不多，直到1894年才有學(xué)者將其命名為“漆酶”。目前，漆酶已在生物制漿、生物漂白、污染物生物降解、生物檢測(cè)、工業(yè)廢水處理等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但漆酶的產(chǎn)量一直不高，滿足不了工業(yè)發(fā)展的需求，因此

有關(guān)漆酶的研究日益受到研究者的關(guān)注［1-3］。目前產(chǎn)漆酶的菌株大部分為真菌，由于真菌生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)酶低等問(wèn)題，使漆酶的產(chǎn)量難以滿足工業(yè)的需要。因此，對(duì)于如何選育開發(fā)產(chǎn)漆酶的新菌種及培養(yǎng)方式顯得極為關(guān)鍵［4］。篩選設(shè)計(jì)（Plackett-Burman design）是通過(guò)數(shù)學(xué)原理利用最少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多因素中篩選出對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生重要影響的因素［5］。響應(yīng)面分析法（Response surface methodology，RSM）是通過(guò)篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)等過(guò)程篩選出影響顯著的因子及水平，再通過(guò)建立回歸擬合方程使響應(yīng)值最接近最高值［6，7］。近年來(lái)響應(yīng)面分析法已被廣泛應(yīng)用于菌株代謝產(chǎn)物的研究中，但對(duì)漆酶的響應(yīng)面優(yōu)化主要集中在黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、雜色云芝（Coriolus versicolor）和毛栓菌（Trametes trogii）等白腐菌的研究［8-12］，而對(duì)于其他優(yōu)良產(chǎn)漆酶菌株研究很少。因此，本研究采用響應(yīng)面法對(duì)革耳菌產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化及利用優(yōu)化后的發(fā)酵液對(duì)竹材木質(zhì)素進(jìn)行降解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 革耳（Panus rudisFG-35），本實(shí)驗(yàn)室篩選自湖南省攸縣黃豐橋國(guó)有林場(chǎng)天然竹林腐爛的竹材中，保存于中國(guó)典型微生物保藏中心（中國(guó)武漢）。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)基：采用基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基?；A(chǔ)液體培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)［13］略有改動(dòng)。

1.1.3 試劑 試驗(yàn)所需的主要試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 漆酶活力的測(cè)定

1.2.1.1 粗酶液的制備 將發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min，4℃條件下離心10 min得到的上清液即為粗酶液，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 漆酶活力測(cè)定 漆酶活力測(cè)定采用ABTS法參考文獻(xiàn)［14］，并稍加改動(dòng)。

1.2.2 產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 不同碳源對(duì)產(chǎn)漆酶的影響 在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別添加1% 碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、羧甲基纖維素鈉、淀粉和玉米粉）為菌株的碳源，于 28℃、160 r/min 的條件下培養(yǎng)7 d后測(cè)定漆酶活性。

1.2.2.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)漆酶的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.2% 氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉粉、酒石酸銨、氯化銨、尿素和豆粕粉）為菌株的氮源，于28℃、160 r/min 的條件下培養(yǎng)7 d后測(cè)定漆酶活性。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 Plackett-Burman篩選顯著因素 Plackett-Burman的設(shè)計(jì)是基于數(shù)學(xué)原理設(shè)計(jì)而成的，它利用最少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多的考察因素中篩選出對(duì)目標(biāo)影響最為重要的幾個(gè)因素［15］。根據(jù)革耳菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)要素選取影響漆酶活力的8個(gè)因素，選用n=16的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定各因素對(duì)革耳菌FG-35產(chǎn)漆酶的影響顯著性。各因素取兩個(gè)水平，高水平和低水平分別是（+）和（-）。

1.2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn) 如果響應(yīng)面的擬合方程不在考察區(qū)間的臨近區(qū)域里，那么擬合方程就毫無(wú)意義。只有響應(yīng)面的擬合方程在考察的臨近區(qū)域內(nèi)才能建立有效的響應(yīng)面的擬合方程［16］。最陡爬坡是通過(guò)試驗(yàn)值的變化來(lái)確定爬坡方向，根據(jù)各因子的變化大小來(lái)判定變化步長(zhǎng)的大小，從而更快、更有效的接近最有效的產(chǎn)酶條件區(qū)域［17］。

1.2.3.3 Box-Behnken確定顯著因素的最佳水平 響應(yīng)面法中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Box-Behnken design）通常是通過(guò)利用連續(xù)的變量而建立起的曲面模型，用來(lái)確定最佳因素的最適水平及相互作用，通常被應(yīng)用在各種優(yōu)化過(guò)程中［17］。通過(guò)Minitab 軟件設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)。

1.2.3.4 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證 以響應(yīng)面設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)的最佳產(chǎn)酶條件，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行3組產(chǎn)酶試驗(yàn)，測(cè)定酶活，與模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，驗(yàn)證模型的有效性。

1.2.4 漆酶降解竹材木質(zhì)素 將經(jīng)預(yù)處理的竹纖維1 g，放入含有120 mL經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基500 mL三角瓶中。接入相同大小的3個(gè)1 cm的菌餅。于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每隔10 d重新添加一次液體培養(yǎng)基，連續(xù)3次，30 d后沖洗、烘干處理后的纖維并對(duì)竹纖維的纖維素和木質(zhì)素含量進(jìn)行測(cè)定，以不加菌種的為空白對(duì)照（每組3個(gè)重復(fù)）。

1.2.4.1 失重率測(cè)定 失重率（%）=（處理前樣品重-處理后樣品重）/處理前樣品重×100%

1.2.4.2 木質(zhì)素和纖維素含量測(cè)定 纖維素含量采用過(guò)濾法；木質(zhì)素含量測(cè)定采用硫酸法（Klason法），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所測(cè)得。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

2.1.1 菌株產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基最佳碳源的確定 從圖1可以看出，由7種不同的碳源為菌株的唯一碳源時(shí)，當(dāng)菌株以可溶性淀粉為碳源時(shí)漆酶活性明顯比其他6種物質(zhì)的酶活高；其次依次為麥芽糖、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、乳糖、玉米淀粉和蔗糖，其中菌株以蔗糖為碳源時(shí)漆酶酶活性最低，因此選取可溶性淀粉作為菌株產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 碳源對(duì)菌株FG-35產(chǎn)漆酶的影響

2.1.2 菌株產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基最佳氮源的確定 由圖2可見，在7種不同氮源為菌株的唯一氮源，其中蛋白胨為氮源時(shí)漆酶活性最高，明顯高于其他6種物質(zhì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白胨、酵母膏、牛肉粉等有機(jī)氮源明顯比酒石酸銨、氯化銨和尿素等無(wú)機(jī)氮源的酶活高，說(shuō)明菌株利用有機(jī)氮能更有利于漆酶的產(chǎn)生，因此選取蛋白胨為菌株產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖2 氮源對(duì)菌株FG-35產(chǎn)漆酶的影響

2.2 Plackett-Burman篩選影響產(chǎn)漆酶因素

在確定最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上，以淀粉、蛋白胨、CuSO4·7H2O、MnSO4、ZnSO4·7H2O、CaCl2、吐溫-40（T-40）及藜蘆醇8個(gè)因素作為產(chǎn)漆酶的考察因素進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)Minitab軟件創(chuàng)建一個(gè)N=16的篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)表。通過(guò)對(duì)表1進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，得到各因素對(duì)產(chǎn)漆酶的影響效應(yīng)（表2），同時(shí)利用Minitab軟件制作影響因素效果圖（圖3）。通過(guò)圖3可直觀地看出各因素影響產(chǎn)漆酶效應(yīng)的重要性。該圖可以清晰的顯示一條在α=0.05水平下P值的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)值為2.365的參考線，任何只要超過(guò)此參考線的影響因素都可能是顯著的。由圖3看出，CaCl2、淀粉和T-40對(duì)產(chǎn)漆酶的影響均較顯著，可信度＞95%，其他因素對(duì)于漆酶不產(chǎn)生顯著性影響。由表2看出，其中只有淀粉對(duì)菌株產(chǎn)漆酶具有顯著正效應(yīng)，而CaCl2和T-40對(duì)于菌株產(chǎn)漆酶有顯著負(fù)效應(yīng)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.1 PB試驗(yàn)所得的結(jié)果（表2）來(lái)確定顯著因素的效應(yīng)決定各因素的爬坡方向和變化步長(zhǎng)，淀粉效應(yīng)系數(shù)為正，表明增大淀粉的量對(duì)產(chǎn)漆酶的效應(yīng)為正；反之，CaCl2和Tween-40效應(yīng)系數(shù)為負(fù)，表明減少CaCl2和Tween-40的量對(duì)產(chǎn)漆酶的效應(yīng)為正，依據(jù)系數(shù)的變量確定試驗(yàn)的基本步長(zhǎng)。而對(duì)于不顯著因素，根據(jù)表現(xiàn)效應(yīng)的正負(fù)來(lái)確定不顯著因素的高水平和低水平。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，4號(hào)處理組中漆酶活力最高，即當(dāng)可溶性淀粉（11 g/L）、CaCl2（0.08 g/L）、T-40（0.4%）時(shí)，在最高產(chǎn)酶的最優(yōu)點(diǎn)附近，因此，以第4組的水平選為中心點(diǎn)對(duì)革耳菌的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.4 響應(yīng)面分析結(jié)果

利用Minitab軟件設(shè)計(jì)一個(gè)以爬坡試驗(yàn)的處理4為中心點(diǎn)的3因素3水平Box-Benhnken 試驗(yàn)，其中設(shè)3個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)，12個(gè)分析點(diǎn)。設(shè)計(jì)影響漆酶響應(yīng)面的各因素和水平見表4，試驗(yàn)結(jié)果見表5。同時(shí)利用軟件Minitab 16 對(duì)表6試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合分析，獲得以漆酶酶活力為預(yù)測(cè)值的多元二次線性回歸方程如下：

表1 篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素與水平

圖3 各因素影響效果的排列圖

表3 最陡爬坡試驗(yàn)及結(jié)果

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行方差分析（表6）。從表6可看出，在α=0.05的顯著水平上，C、A2、B2、C2、BC的影響水平顯著，其余項(xiàng)對(duì)于漆酶的影響不顯著。通過(guò)表6看出，回歸方程的P值=0.003，達(dá)到顯著水平，說(shuō)明回歸模型顯著，而失擬項(xiàng)的P值為0.876，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，表明其他因素對(duì)于漆酶試驗(yàn)結(jié)果的干擾很小，說(shuō)明方程與實(shí)際試驗(yàn)有很好的擬合，模型設(shè)計(jì)適合。而模型的決定系數(shù)R2=0.948 1直接說(shuō)明培養(yǎng)基中的可溶性淀粉、CaCl2和T-40對(duì)革耳FG-35產(chǎn)漆酶有94.81%的擬合度。

通過(guò)Minitab 16軟件作出各因素交互作用對(duì)漆

酶酶活影響的響應(yīng)曲面和等高線圖（圖4-圖6）。圖4和圖5的響應(yīng)面圖顯示，隨著培養(yǎng)基中可溶性淀粉濃度的增加漆酶的產(chǎn)量逐漸增加，在可溶性淀粉濃度接近10.040 4 g/L左右，漆酶產(chǎn)量最大，當(dāng)濃度超過(guò)10.040 4 g/L后，漆酶產(chǎn)量逐漸降低；圖6的響應(yīng)面顯示，當(dāng)CaCl2和T-40相互作用時(shí)，對(duì)于漆酶的產(chǎn)量有很顯著的影響，當(dāng)CaCl2和吐溫-40的濃度在0.816 g/L和0.428 g/L時(shí)漆酶產(chǎn)量達(dá)到最高。

表5 Box-Behnken 設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表6 二次多項(xiàng)式方差分析

圖4 淀粉與CaCl2交互影響酶活力的響應(yīng)面圖及等高線

為了求得培養(yǎng)基最佳濃度，利用Minitab 16軟件獲得非線性回歸模型和響應(yīng)面后，對(duì)回歸方程的每個(gè)變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，得到Y(jié)的極大值在：A=10.040 4 g/L，B=0.816 g/L，C=0.428 g/L時(shí)，即得到最大產(chǎn)漆酶值，綜合以上得到革耳菌產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)基為：可溶性淀粉 10.040 4 g/L、蛋白胨0.2 g/L、K2HPO41.00 g/L、ZnSO4·7H2O 0.008 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CuSO4·7H2O 0.007 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO40.035 g/L、CaCl20.081 6 g/L、VB10.1 g/L、吐溫-40 0.428%。

通過(guò)對(duì)最優(yōu)培養(yǎng)基的模型進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果試驗(yàn)的產(chǎn)酶量分別為259.811、262.489和266.129 U/mL，平均值為263.31 U/mL，與模型的預(yù)測(cè)值基本一致，因此可以說(shuō)明該模型能較好的預(yù)測(cè)實(shí)際產(chǎn)酶情況。而未優(yōu)化條件前測(cè)得的酶活力為127.194 U/mL，因此優(yōu)化后漆酶的活力比未優(yōu)化的酶活力提高了1.07倍。

圖5 淀粉與T-40交互影響酶活力的響應(yīng)面圖及等高線

圖6 CaCl2與T-40交互影響酶活力的響應(yīng)面圖及等高線

2.5 降解竹材木質(zhì)素結(jié)果

經(jīng)過(guò)竹材木質(zhì)素降解試驗(yàn)后的樣品的失重率、木質(zhì)素降解率和纖維素降解率結(jié)果（表7）表明，通過(guò)與空白對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后處理組降解木質(zhì)素后對(duì)竹材木質(zhì)素的降解率達(dá)21.69%，比未優(yōu)化的培養(yǎng)合基的木質(zhì)素降解率提高了14.34%，因此可以說(shuō)明經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化后漆酶的提高對(duì)木質(zhì)素的降解有很好的促進(jìn)作用。

表7 漆酶對(duì)木質(zhì)素降解的影響

3 討論

在研究菌株的代謝產(chǎn)物中，通常優(yōu)化培養(yǎng)基的方法有兩種：一種是利用確定每個(gè)單因素的影響得到菌株的最佳生長(zhǎng)條件，而各因素間的相互作用被忽略，因此得到的培養(yǎng)基不是最佳的優(yōu)化條件；另一種是通過(guò)科學(xué)合理的設(shè)計(jì)并同時(shí)考慮幾個(gè)因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，尋找最佳的各因素水平組合，但正交實(shí)驗(yàn)不能得到回歸方程，從而無(wú)法對(duì)影響菌株的因素進(jìn)行再優(yōu)化［18］。而響應(yīng)面分析法卻克服了正交實(shí)驗(yàn)無(wú)法使各影響因子達(dá)到最優(yōu)組合的狀況，從而使優(yōu)化的因子更趨近于最優(yōu)。目前很多研究者［19-22］通過(guò)中心設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法在優(yōu)化培養(yǎng)基及優(yōu)化工藝中取得了很好的效果。而本研究通過(guò)響應(yīng)面分析法，以漆酶產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用多元二次回歸擬合方程，并通過(guò)求得的偏導(dǎo)數(shù)得到顯著影響因子。培養(yǎng)基為菌株生長(zhǎng)、繁殖、代謝提供不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)了解菌株的生理生化特性有非常重要的影響。因此篩選出優(yōu)良的木質(zhì)素降解菌株后，對(duì)菌株培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究顯得尤為重要。故本研究

首先通過(guò)單因素試驗(yàn)確定革耳Panus rudis FG-35菌株產(chǎn)漆酶最佳的氮源為可溶性淀粉，產(chǎn)漆酶的最佳氮源為蛋白胨。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首先通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)從眾多的影響因素中篩選出對(duì)革耳Panus rudisFG-35菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶影響顯著的因素。同時(shí)在Plackett-Burman試驗(yàn)、爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)淀粉、CaCl2和T-40 3個(gè)主要影響漆酶產(chǎn)生的因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立影響產(chǎn)漆酶數(shù)學(xué)模型，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)模型進(jìn)行顯著性分析，找出使模型達(dá)到最大值時(shí)各因素的水平，得出革耳Panus rudisFG-35菌株產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)基。

通過(guò)利用經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化后的發(fā)酵液對(duì)竹材木質(zhì)素降解，使竹材木質(zhì)素的降解率提高了14.34%，說(shuō)明漆酶產(chǎn)量的提高對(duì)于木質(zhì)素的降解有很好的促進(jìn)作用，而對(duì)纖維素?zé)o明顯的降解作用。通過(guò)這一特性可在今后嘗試?yán)貌粩嗵砑友a(bǔ)料或替換發(fā)酵液方法使竹材的木質(zhì)素得到進(jìn)一步充分降解，為將來(lái)研究微生物提取竹原纖維提供借鑒和參考。

4 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)革耳FG-35菌株產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后漆酶活力最大值比原始培養(yǎng)基提高了1.07倍，為263.735 U/mL。得到了革耳FG-35菌株的最佳產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基配方；經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化后漆酶的提高對(duì)木質(zhì)素的降解發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的發(fā)酵液對(duì)使竹材木質(zhì)素的降解率提高了14.34%。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optimization of Components for Laccase Production by Panus rudis FG-35 Using Response Surface Methodology

Liu Jian Liu Jun’ang Zhou Guoying Li He Yang Jing
（1. The Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. College of Forestry，Central South University of Forestry ＆ Technology，Changsha 410004）

We optimized the liquid medium components to produce the laccase activity of Panus rudis FG-35 by using Plackett-Burman design and response surface methodology. The results of single-factor test showed that soluble starch and peptone were the best sources of carbon and nitrogen. Then the Plackett-Burman design was applied to determine the specific medium components affecting laccase activity and found that soluble starch, Ca2+and Tween-40 were the key factors. Based on these results, steepest ascent experiments were applied to find central points of laccase activity. These significant parameters were further optimized using Box-Behnken design, response surface methodology and regression analysis. Finally, the optimal medium was：soluble starch 10.040 4 g/L, peptone 0.2 g/L, K2HPO41.00 g/L, ZnSO4·7H2O 0.008 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, CuSO4·7H2O 0.007 g/L, FeSO4·7H2O 0.005 g/L, MnSO40.035 g/L, CaCl20.081 6 g/L, VB10.1 g/L, Tween-40 0.428%. Under these optimal conditions, the activity of laccase increased from 263.31 U/mL to 127.194 U/mL（1.0-fold increase in total yield）, similar to the predictions. And the results of lignin degradation experiments indicated that the optimal medium made contribution to the degradation rate of lignin which about 14.34% improvement over before.

Laccase Plackett-Burman design Response surface Degradation

2014-01-20

湖南省科技重大專項(xiàng)（2011FJ1006），林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201004014），中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CX2012B15）

劉劍，男，碩士研究生，研究方向：林業(yè)應(yīng)用微生物；E-mail：408199303@qq.com

周國(guó)英，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：林業(yè)微生物開發(fā)；E-mail：gyzhou2118@163.com