黃怡誠(chéng) 劉旸 龐昕 馬中瑞 韓東雷 陳敏

（山東大學(xué)生命科學(xué)院 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

產(chǎn)胞外多糖植物內(nèi)生菌的分離和鑒定

黃怡誠(chéng) 劉旸 龐昕 馬中瑞 韓東雷 陳敏

（山東大學(xué)生命科學(xué)院 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

利用平板涂布法從胡蘿卜、蘆薈、土豆、地瓜和紫薯樣品中分離得到24株細(xì)菌，利用苯酚硫酸法測(cè)定菌株胞外多糖的產(chǎn)量，最終得到3株高產(chǎn)胞外多糖的細(xì)菌菌株25-Z-1、25-Z-3和12-L-6。經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，從紫薯樣品中分離得到的25-Z-1與Bacillus pumilus strain ST277處于同一分支，相似性達(dá)到100%；25-Z-3與Bacillus cereus strain Se05 處于同一分支，相似性達(dá)到99%；從蘆薈中分離得到的12-L-6與Bacillus sp. GZT 處于同一分支，相似性為99%。在LB液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)170 r /min條件下，發(fā)酵7 d后胞外多糖產(chǎn)量可分別達(dá)30.3 mg/L、29.1 mg/L及28.2 mg/L。

植物內(nèi)生菌 胞外多糖 16S rDNA

近年來(lái)，由于細(xì)菌多糖具有安全、無(wú)毒等理化性質(zhì)，使其在多個(gè)領(lǐng)域倍受青睞，尤其是在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域所具有的巨大應(yīng)用價(jià)值引起人們的廣泛關(guān)注［1］。目前，許多細(xì)菌胞外多糖已在這些領(lǐng)域作為膠凝劑、成膜劑、保鮮劑得到廣泛應(yīng)用。目前研究的產(chǎn)胞外多糖細(xì)菌主要有醋酸桿菌（Acetobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、黏細(xì)菌（Myxobacterium）、芽孢桿菌（Bacillus）、鏈球菌（Streptococcus）、乳球菌（Lactococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）等［2，3］。但對(duì)植物內(nèi)生菌胞外多糖的研究甚少。

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是一種新的微生物資源，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，從植物內(nèi)生菌中尋找新的生物活性物質(zhì)的研究成為熱點(diǎn)［4］。植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)往往是無(wú)毒無(wú)害的，具備在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域大規(guī)模生產(chǎn)的條件。因此，從植物內(nèi)生菌中開(kāi)發(fā)產(chǎn)糖性狀優(yōu)良的菌株，將有助于細(xì)菌多糖的相關(guān)研究，為工業(yè)化生產(chǎn)及多領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供篩選分離產(chǎn)胞外多糖菌株的樣品包括胡蘿卜、蘆薈、土豆、地瓜和紫薯從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)所得，帶回實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行表面沖洗，消毒等處理及內(nèi)生菌分離。

1.1.2 主要試劑和儀器 PCR所用引物由上海生物工程技術(shù)公司合成；Buffer、dNTP、Taq酶及其它常規(guī)試劑均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、磷酸二氫鉀、無(wú)水硫酸鎂、蔗糖、硝酸鈉、無(wú)水乙醇等藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。蛋白胨、酵母浸粉和瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。PTC2200 PCR擴(kuò)增儀，YLN-III暗箱式紫外分析儀（北京市亞力恩機(jī)電技術(shù)研究所），Model 680 酶標(biāo)儀（伯樂(lè)公司），小型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）。

1.1.3 培養(yǎng)基 初篩培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖15，蛋白胨3，酵母膏2，NaNO30.5，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 10，瓊脂 15，pH7.0-7.2。

以上培養(yǎng)基均在100 kPa高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與篩選 初篩：清水洗凈植物樣品，75% 乙醇1 min，1% 次氯酸鈉5 min，無(wú)菌水漂洗3-5次。最后一次的漂洗水用于涂布平板。（驗(yàn)證是否外周菌清洗干凈）用剪刀或刀片將植物減碎，或剝?nèi)ケ砥ぃ瑢o(wú)表皮除貼于平板?；蛘邔⒅参镄K直接放入LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-36 h后，稀釋菌液，涂布平板［5，6］。復(fù)篩：將初篩選出的菌種，進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。運(yùn)用酶標(biāo)儀測(cè)量使它們的OD處于相同數(shù)值，在初篩培養(yǎng)基上使用點(diǎn)種法，培養(yǎng)2 d，觀(guān)察產(chǎn)糖圈大小［7］。

將初篩得到的產(chǎn)糖圈大的菌種接入含有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，在28℃，160 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，得到的發(fā)酵液4 500 r/min離心15 min，取上清液加入1 mL，加入4 mL無(wú)水乙醇沉淀多糖，產(chǎn)生絮狀沉淀，3 000 r/min離心10 min，用2 mL蒸餾水復(fù)溶多糖后［8］，使用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖量［9］。

1.2.2 苯酚硫酸法測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：準(zhǔn)確稱(chēng)量100 mg葡萄糖于100 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取16、24、32、40、48、56、64和72 μL，各以蒸餾水補(bǔ)足至80 μL，然后加入6%苯酚40 μL及濃硫酸200 μL，混勻冷卻，室溫放置20 min后于490 nm測(cè)光密度，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征 將獲得的目標(biāo)菌株在LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，同時(shí)觀(guān)察記錄菌落形態(tài)。然后進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀(guān)察。取部分菌體送山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院電鏡室進(jìn)行掃描電鏡觀(guān)察。同時(shí)，將25-Z-1菌株接種至半固體培養(yǎng)基，穿刺培養(yǎng)，觀(guān)察其運(yùn)動(dòng)情況以判斷該菌是否著生鞭毛。

1.2.3.2 生理生化試驗(yàn) 分別從細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、耐鹽性、酶反應(yīng)、水解試驗(yàn)、碳源利用情況等幾個(gè)方面對(duì)25-Z-1菌株進(jìn)行研究。NaCl濃度為7%，平行3組，無(wú)菌操作接種至細(xì)菌培養(yǎng)微孔板中，毎孔200 μL。使用Bioscreen儀，37℃，200 r/min培養(yǎng)4 d，每間隔30 min對(duì)每孔菌液進(jìn)行600 nm下的光密度測(cè)量。數(shù)據(jù)同時(shí)傳輸?shù)诫娔X上，自動(dòng)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以測(cè)定菌株的耐鹽性。其他試驗(yàn)參考文獻(xiàn)《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［10］和《伯杰氏手冊(cè)》［11］，用細(xì)菌生理生化微量鑒定管進(jìn)行（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2.3.3 16S rDNA測(cè)序 使用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。以提取的細(xì)菌總DNA為模板。16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物：F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）［11］。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；55℃退火1 min，74℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；74℃延伸5 min，4℃保存［12］。PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化后測(cè)序，將得到的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上BLAST進(jìn)行比對(duì)。采用MEGA（version 411）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Neighbor-Joining法對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析［13］。

2 結(jié)果

2.1 胞外多糖高產(chǎn)酵母菌株的分離篩選

從5種植物樣品中共分離得到24株菌株，經(jīng)初篩、復(fù)篩得到胞外多糖高產(chǎn)菌株3株。部分結(jié)果（表1）顯示，經(jīng)7 d的發(fā)酵后，菌株25-Z-1、25-Z-3和

12-L-6，胞外多糖產(chǎn)量較高，將這3株菌株作為復(fù)篩入選菌株進(jìn)行菌落的形態(tài)觀(guān)察和菌種鑒定試驗(yàn)。

表1 胞外多糖高產(chǎn)菌株的篩選結(jié)果

2.2 菌落形態(tài)特征

經(jīng)過(guò)篩選后，菌株25-Z-3、25-Z-1和12-L-6為高產(chǎn)胞外多糖的入選菌株，在顯微鏡下觀(guān)察，3株菌株均為直桿狀。25-Z-1菌體呈短桿狀，染色均勻、革蘭氏染色陽(yáng)性，不具運(yùn)動(dòng)性。將菌株在LB平板上涂布培養(yǎng)分離16 h后，25-Z-3和25-Z-1菌落直徑為5.5-6.0 mm，12-L-6菌落直徑為6.2-6.7 mm，菌落形狀均是圓形，表面光滑濕潤(rùn)，顏色呈白色。

圖1 菌株25-Z-3、25-Z-1和12-L-6在平板上的形態(tài)

2.3 菌株25-Z-1的形態(tài)特征

菌株25-Z-1在掃描電鏡下觀(guān)察的形態(tài)特征（圖2），菌體呈細(xì)短桿狀，兩端鈍圓。

2.4 菌株生理生化分析

菌株7% NaCl 條件下生長(zhǎng)；不具有運(yùn)動(dòng)能力，氧化酶、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、L-賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)均為陰性，具有β-半乳糖苷酶、L-精氨酸雙水解酶活性，不從D-木糖產(chǎn)酸，但是從N-乙酰-D-葡糖胺產(chǎn)酸。分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、D-果糖；不分解乳糖、甘露醇、D-纖維二糖、N-乙酰葡糖胺、鼠李糖、D-棉子糖、阿拉伯糖、核糖、山梨醇。不分解尿素，七葉苷（表2，表3）。

圖2 掃描電鏡下菌株25-Z-1的形態(tài)特征（10 000×）

表2 25-Z-1菌株生理生化分析

2.5 菌株16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

將提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且純化。經(jīng)PCR擴(kuò)增，3個(gè)菌株擴(kuò)增出預(yù)期的1 500 bp 左右的16S rDNA片段。序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行BLAST分析，經(jīng)ClustalX多序列聯(lián)配，利用MEGA軟件對(duì)菌株25-Z-3、25-Z-1、12-L-6和模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。結(jié)果（圖3）表明，從紫薯樣品中分離得到的25-Z-1與Bacillus pumilusstrain ST277處于同一分支，25-Z-3與Bacillus cereusstrain Se05 處于同一分支，相似性達(dá)到99%；從蘆薈中分離得到的12-L-6與Bacillussp. GZT 處于同一分支，相似性為99%。

表3 25-Z-1菌株碳源利用分析

圖 3 菌株25-Z-3、25-Z-1和12-L-6的 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

植物內(nèi)生菌是多樣性十分豐富的微生物類(lèi)群，分布于沒(méi)有外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)，并與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，其存在和作用長(zhǎng)期以來(lái)一直為人們所忽視。近年來(lái)，植物內(nèi)生真菌研究引起人們的注意。目前盡管人們?cè)谥参飪?nèi)生菌的種類(lèi)、代謝產(chǎn)物、與宿主之間的相互關(guān)系等方面取得一些成果，但研究還很不深入，特別是對(duì)內(nèi)生菌的利用還不多。

紫薯（Ipomoea batataspoir），原名川山紫，屬旋花科一年生草本植物。紫薯含有一種多糖和蛋白質(zhì)混合物，稱(chēng)為黏蛋白，屬膠原和黏多糖類(lèi)物質(zhì)，這種物質(zhì)可減輕疲勞，提高人體免疫力［15］，目前有關(guān)紫薯內(nèi)生菌的研究尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道. 對(duì)紫薯內(nèi)生菌進(jìn)行了分離鑒定，研究其生物多樣性、生物學(xué)特征，闡明其與宿主植物的相互關(guān)系以及探索其實(shí)際應(yīng)用的可能性等，可以為更好地利用紫薯這一植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

在植物內(nèi)生菌中，目前芽孢桿菌的許多種被列為益生菌而常常用于發(fā)酵制備各種酶或其他代謝產(chǎn)物。近些年來(lái)芽孢桿菌被用于生物農(nóng)藥，生物肥料，果聚糖的生產(chǎn)等多個(gè)領(lǐng)域［16］。本研究中篩選得到的芽孢桿菌從16S rDNA上看屬于不同的芽孢桿菌，25-Z-3 和Bacillus cereusstrain Se05 比較相近，Bacillus cereusstrain Se05 是一株植物內(nèi)生菌，與Bacillus cereusATCC 14579T（AE016877）同源性為 99.79%，對(duì)植物病原菌具有拮抗作用［17］。12-L-6所屬的Bacillussp. GZT，具有降解2，4，6-tribromophenol的功能［18］。產(chǎn)糖量最高的25-Z-1從16S rDNA看接近于Bacillus pumilus，但在生理狀態(tài)上仍然有所不同，因此有待于進(jìn)一步的鑒定。本菌株產(chǎn)胞外多糖的能力較強(qiáng)，這一高產(chǎn)特性顯示了在生產(chǎn)實(shí)際中有很好的應(yīng)用潛力，值得作進(jìn)一步研究。另外，植物來(lái)源的內(nèi)生芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外多糖有何特性，其分子結(jié)構(gòu)組成如何等，也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

利用平板涂布法從胡蘿卜、蘆薈、土豆、地瓜和紫薯樣品中分離得到24株細(xì)菌，利用苯酚硫酸法測(cè)定菌株胞外多糖的產(chǎn)量，最終得到3株高產(chǎn)

胞外多糖的細(xì)菌菌株25-Z-1、25-Z-3和12-L-6，并對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定。 經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，從紫薯樣品中分離得到的25-Z-1與Bacillus pumilusstrain ST277處于同一分支，相似性達(dá)到100%；25-Z-3與Bacillus cereusstrain Se05 處于同一分支，相似性達(dá)到99%；從蘆薈中分離得到的12-L-6與Bacillussp. GZT 處于同一分支，相似性為99%。 在LB液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)170 r/min條件下，發(fā)酵7 d后胞外多糖產(chǎn)量可分別達(dá)30.3 mg/L、29.1 mg/L及28.2 mg/L。

［1］ 文一, 趙國(guó)華. 一種新型微生物胞外多糖--結(jié)冷膠［J］. 中國(guó)食品添加劑, 2003（3）：49-52.

［2］ Purama RK, Goswami P, Khan AT, et al. Structural analysis and properties of dextran produced by Leuconosto cmesenterides NRRLB 640［J］. Carbohydrate Polymers, 2009, 76：30-35.

［3］ 江曉路, 郭靜, 李蓉. 拉恩氏菌Rahnella sp. PJT 09發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的研究［J］. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 40（8）：66-72.

［4］ 劉蘊(yùn)哲, 何勁, 張杰, 等. 植物內(nèi)生真菌及其活性代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展［J］. 菌物研究, 2005, 3（4）：30-34.

［5］ Evans NA, Hoyne PA, Stone BA. Characteristics and specificity of the interaction of a fluorochrome from aniline blue（sirofluor）with polysaccharides［J］. Carbohydrate Polymers, 1984, 4（3）：215-230.

［6］ 葉凱貞, 黎碧娜, 王奎蘭, 等. 多糖的提取, 分離與純化［J］.廣州食品工業(yè)科技, 2004, 20（3）：144-146.

［7］ Wingendes J, Neu TR, Flemming HC. Microbial extracellular polymeric substances：characterization, structure and function［M］. NewYork：Springer Press, 1999.

［8］ AlmironRoig E, Mulholland F, Gasson M, et al. The complete cps gene cluster from Streptococcus thermophilus NCFB2393 involved in the biosynthesis of a new exopolysacchaaride［J］. Microbiology, 2000, 146：2793- 2802.

［9］ Patel AK, Philippe M, Reeta RS, et al. Polysaccharides from probiotics：new developments as food additives［J］. Food Technol Biotechnol, 2010, 48（4）：451-463.

［10］ 東秀珠, 蔡妙瑛. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2001.

［11］ 布坎南RE, 吉本斯NE, 等. 伯杰細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］. 第八版. 北京：科學(xué)出版社, 1984.

［12］ Sutherland IW, Novel and established applications of microbial polysaccharide［J］. Tibtech, 1998, 16（1）：41-46.

［14］ Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method：A new method for recon-structing phylogenetic trees［J］. Mol Biol Evol, 1987, 4（4）：406-425.

［15］ 李世敏. 功能食品加工技術(shù)［M］. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2006.

［17］ Ma L, Cao YH, Cheng MH, et al. Phylogenetic diversity of bacterial endophytes of Panax notoginseng with antagonistic characteristics towards pathogens of root-rot disease complex［J］. Antonie Van Leeuwenhoek. 2013, 103（2）：299-312.

［18］ Zu L, Li G, An T, Wong PK. Biodegradation kinetics and mechanism of 2, 4, 6-tribromophenol by Bacillus sp. GZT：a phenomenon of xenobiotic methylation during debromination［J］. Bioresour Technol, 2012, 110：153-9.

（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation and Characterization of Endophytic Strains Producing Exopolysaccharide

Huang Yicheng Liu Yang Pang Xin Ma Zhongrui Han Donglei Chen Min
（The State Key Laboratory of Microbial Technology，School of Life Sciences，Shandong University，Jinan 250100）

In this study, 24 strains were isolated from carrot, aloe, potato, sweet potato and purple potato. As screening by phenol-sulfuric acid assay, three strains, 25-Z-1, 25-Z-3 and 12-L-6, were proved to be as high exopolysaccharide producing strains. The results of 16S rDNA sequence determination showed that 25-Z-1 and 25-Z-3 isolated from purple potato was about 100% identity compared with Bacillus pumilus strain ST277 and 99% identity compared with Bacillus cereus strain Se05, respectively. Meanwhile the 12-L-6 isolated from aloe identified as Bacillus sp. GZT, with the similarity is of 99%. Culture in LB medium, 30℃ and 170 r/min for 7 d, yield of EPS could reach to 30.3 mg/L, 29.1 mg/L and 28.2 mg/L, respectively.

Endophyte Exopolysaccharide 16S rDNA

2013-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270983，31070824），教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目第45批，山東省自然科學(xué)基金（2009ZRB019SQ）

黃怡誠(chéng)，男，研究方向：糖生物學(xué)， E-mail：61828624@qq.com；劉旸同為本文第一作者

陳敏，博士，副教授，研究方向：糖生物學(xué)；E-mail：chenmin@sdu.edu.cn