盧 習(xí) 范 力 邵 虹 段明慧 陳樹(shù)林 趙善廷 (西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊陵 712100)

哺乳動(dòng)物的大腦皮質(zhì)是一個(gè)高度有序的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從軟腦膜(Pial mater)到白質(zhì)(White matter)是由不同類(lèi)型的細(xì)胞排列而成的六層結(jié)構(gòu)，每一層的神經(jīng)元具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能特性，并且在同一時(shí)間起源于同一地點(diǎn)［1］。在哺乳動(dòng)物大腦皮質(zhì)發(fā)育時(shí)期，有絲分裂后的神經(jīng)元從它們的發(fā)源地沿著放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的突起向軟腦膜遷移，最后會(huì)以“由內(nèi)而外”(Inside out)的方式形成高度有序排列的六層結(jié)構(gòu)［2］，即較早出生的神經(jīng)元最終定位于皮層深處，而晚出生神經(jīng)元最終占據(jù)著淺層區(qū)域。神經(jīng)元遷移缺陷會(huì)導(dǎo)致許多神經(jīng)元疾病，例如無(wú)腦回(Lissencephaly)、癲癇(Epilepsy)、智力遲鈍(Mental retardation)和嚴(yán)重的學(xué)習(xí)障礙(Iearning disabilities)［3，4］。神經(jīng)元遷移依靠不同信號(hào)通路的精確調(diào)控，其中最具特色的是搖晃蛋白(Reelin)信號(hào)通路。

在大腦皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中，位于邊緣帶(Marginal zone，MZ)的Cajal-Retzius 細(xì)胞(CR cells)分泌的一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，稱(chēng)為搖晃蛋白(Reelin)。在大腦皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中，搖晃蛋白控制著神經(jīng)元遷移和大腦皮質(zhì)的形成過(guò)程。在缺失搖晃蛋白的突變體小鼠(搖晃小鼠，Reeler mouse)的大腦皮質(zhì)、海馬和小腦中神經(jīng)元的遷移嚴(yán)重受阻，最終導(dǎo)致層結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)［5］。

以前研究發(fā)現(xiàn)，除了大腦皮質(zhì)的層結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)外，純合子搖晃小鼠海馬中樹(shù)突發(fā)育異常，排列紊亂［6，7］。樹(shù)突分枝朝向紊亂的程度與細(xì)胞層異位的程度相一致，表明發(fā)育樹(shù)突的朝向受位置信號(hào)的影響。雜合子搖晃小鼠在沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞層異位的情況下仍表現(xiàn)出樹(shù)突長(zhǎng)度變短，樹(shù)突棘(Dendritic spine)密度減?。?］，這表明搖晃蛋白的缺失本身可能影響樹(shù)突發(fā)育和神經(jīng)元成熟。

本研究通過(guò)子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染的方法，標(biāo)記遷移中的神經(jīng)元，觀察到在接近含搖晃蛋白的MZ 附近，遷移神經(jīng)元開(kāi)始出現(xiàn)分枝，表現(xiàn)出與在遷移中完全不一樣的表型。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)搖晃蛋白引起神經(jīng)元分枝，因此神經(jīng)元的發(fā)育與搖晃蛋白之間有著密切的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究工作中使用的動(dòng)物為孕期E15.5 的野生型C57BL/6J 小鼠。成年C57BL/6J小鼠(2 月齡)購(gòu)自于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠首先放置于實(shí)驗(yàn)室鼠房［室溫(22±1)℃，相對(duì)濕度50%～60%］適應(yīng)7 d。按照雌∶雄=2∶1 的比例進(jìn)行合籠，次日上午檢查陰栓，若見(jiàn)陰栓，當(dāng)天中午記為E0.5(Embryonic day 0.5)。小鼠出生的當(dāng)天記為P0(Postnatal day 0)。

1.2 子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染 子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方法參照Saito 等［9］的文獻(xiàn)進(jìn)行，并做適當(dāng)修改。

取E15.5 孕鼠，用0.7%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射(70 mg/kg)，麻醉后將其腹部向上置平板上，用碘伏和酒精棉反復(fù)交替消毒腹部皮膚，用中間開(kāi)口的無(wú)菌手術(shù)墊單覆蓋腹部，沿腹中線剪開(kāi)皮膚和肌肉，將一側(cè)子宮輕輕拉出，找到腦部人字縫，判斷側(cè)腦室的位置，以左手固定胎鼠，用玻璃微注射針(圖1A、C 中箭形所示)將pCAG-GFP(Plasmid 11150，Addgene，Cambridge，MA，USA)1.5 μl/μg 注射到鼠胚一側(cè)側(cè)腦室，其中含0.01% 固綠(Fast green)作為指示劑，用板狀電極(圖1B、D 黑色所示)輕輕夾住胎腦，按照如下參數(shù)進(jìn)行電脈沖刺激:電壓45 V，脈沖時(shí)間50 ms，脈沖間隔950 ms，電擊次數(shù)5 次。在此過(guò)程中，持續(xù)往子宮上滴加預(yù)熱到37℃的無(wú)菌生理鹽水。轉(zhuǎn)染完畢，將子宮輕輕放回腹腔中，以預(yù)熱生理鹽水灌滿(mǎn)腹腔后將肌肉和皮膚分別縫合。手術(shù)完畢，將母鼠放回籠中，保溫至清醒，分別飼養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后3 d 或5 d 后，打開(kāi)母鼠腹腔，取出胚胎，若出生則取新生小鼠灌注取材。

1.3 熒光免疫組織化學(xué)染色 取出的胚胎大腦在4%多聚甲醛中固定3 d 后，用4%瓊脂包埋，振蕩切片機(jī)切片，厚度50 μm，于pH7.4 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液(Phosphate buffer，PB)中保存，隨后進(jìn)行免疫熒光染色。

熒光免疫組織化學(xué)染色采用“三步法”在24 孔培養(yǎng)板中進(jìn)行漂片染色，孵育及漂洗過(guò)程均在低速搖床上進(jìn)行。使用的一抗包括:rabbit anti-GFP(1∶1 000;A-11122，Invitrogen，Karlsruhe，Germany)，mouse anti-Reelin G10 (1 ∶1 000;MAB5364，Millipore，Billerica，MA，USA);二抗包括goat anti rabbit-Alexa Fluor 488，goat anti mouse-Alexa Fluor 568。用PI(Propidium iodide，2.5 mg/ml;P3566，Invitrogen，Karlsruhe，Germany)或DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole，1 ∶10 000;236276，Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)室溫下復(fù)染15 min 以標(biāo)記細(xì)胞核。腦片用防熒光淬滅劑(Fluorescence Mounting Medium，S3023，DAKO，Copenhagen，Denmark)封片，然后在Zeiss LSM 510激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.4 熒光顯微觀察與激光共聚焦顯微拍照 在Nikon 熒光體視顯微鏡下觀察取出的完整的小鼠腦或胚胎腦，確定轉(zhuǎn)染效果及GFP 表達(dá)的腦區(qū)。在Zeiss LSM 510 激光共聚焦顯微鏡下主要觀察被GFP 標(biāo)記上的細(xì)胞的形態(tài)以及分布的部位。

圖1 子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染示意圖Fig.1 Illustration of in utero electroporation procedure

1.5 細(xì)胞形態(tài)分析 使用Zeiss LSM510 激光共聚焦顯微鏡(×60，1.4 倍物鏡孔徑)對(duì)切片進(jìn)行z 軸連續(xù)掃描拍照，然后通過(guò)Zeiss ZEN 2010 軟件依據(jù)“最大像素密度”將每一組照片進(jìn)行疊加成一個(gè)平面。通過(guò)Neuromantic 軟件描繪出單個(gè)神經(jīng)元的形態(tài)和突起。細(xì)胞的每根突起的長(zhǎng)度可以通過(guò)Image J 軟件測(cè)量出來(lái)。為了分析突起的形態(tài)特征，本實(shí)驗(yàn)分析了以下兩個(gè)參數(shù):總的分枝長(zhǎng)度(Total branch length，TBL)及分枝點(diǎn)(Bifurcation)數(shù)目。將從頂突起上伸出的長(zhǎng)度大于2.5 μm 的GFP 陽(yáng)性突起定義為初級(jí)分枝，從頂突起上伸出的長(zhǎng)度小于2.5 μm 的不穩(wěn)定絲狀偽足不計(jì)入分枝內(nèi)。將從神經(jīng)元胞體和頂突起間的收縮部位到第一個(gè)分枝點(diǎn)的距離定義為剩余頂突起的長(zhǎng)度(Length of leading process)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間的比較進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Dennet t 檢驗(yàn)。所有結(jié)果以±s 表示，P ＜0.05 記為數(shù)據(jù)有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 搖晃蛋白局限性分布于發(fā)育中大腦皮質(zhì)的MZ 用G10 抗體做免疫組織化學(xué)染色可以顯示搖晃蛋白在胚胎大腦皮質(zhì)中的分布位置。G10 抗體是一種單克隆IgG 抗體，可以識(shí)別搖晃蛋白N 末端序列上的第164～496 位氨基酸。免疫組化結(jié)果顯示，搖晃蛋白主要分布在大腦皮質(zhì)胞核較為稀疏的MZ區(qū)，呈現(xiàn)出一種較好的彌散性的分布模式(圖2 A，A')。在放大圖中可以看到，MZ 中許多細(xì)胞顯示出強(qiáng)烈的搖晃蛋白陽(yáng)性，呈現(xiàn)出典型的CR 細(xì)胞特征，水平朝向，帶有粗的突起的雙極形態(tài)，胞體為卵圓形或梭形(箭頭)。在MZ 中的CR 細(xì)胞之間，檢測(cè)到較強(qiáng)的、呈彌散點(diǎn)狀分布的搖晃蛋白分布(圖2 B，B')。

圖2 胚胎期大腦皮質(zhì)中搖晃蛋白的分布Fig.2 Restricted expression of Reelin in embryonic cerebral cortex

圖3 通過(guò)子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)用GFP 標(biāo)記胚胎大腦中神經(jīng)元Fig.3 Neurons were labeled by GFP in embryonic brain transfected using in utero electroporation

2.2 利用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)成功標(biāo)記遷移神經(jīng)元 利用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)，在小鼠胚胎的不同發(fā)育時(shí)期，將帶有CAG 啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)表達(dá)質(zhì)粒(pCAGGFP)注射入小鼠胚胎側(cè)腦室，在一定的電脈沖刺激下，外源質(zhì)粒進(jìn)入胚胎側(cè)腦室的室?guī)е械纳窠?jīng)前體細(xì)胞中，在CAG 啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，GFP 在轉(zhuǎn)染中的細(xì)胞中表達(dá)。

圖4 搖晃蛋白促進(jìn)神經(jīng)元的分枝和樹(shù)突的發(fā)育Fig.4 Reelin promoted branching of neurons and dendritic development

在不同的發(fā)育階段，將剝離頭蓋骨的小鼠胚胎完整腦組織或是出生后小鼠腦組織放置于Nikon 熒光體視顯微鏡下，在質(zhì)粒濃度較高及恰當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染條件下可以直接觀察到強(qiáng)烈的GFP 陽(yáng)性表達(dá)(圖3C)。

在E15.5 d 進(jìn)行子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染，3 d 后E18.5 d 固定的小鼠胚胎大腦中，可以觀察到在發(fā)育中的大腦皮質(zhì)的皮質(zhì)板(Cortical plate，CP)、中間帶(Intermediate zone，IZ)和室?guī)?Ventricular zone，VZ)/亞室?guī)?Subventricular zone，SVZ)中均有大量的GFP 陽(yáng)性的細(xì)胞被成功標(biāo)記(圖3A，A')。在CP 中的GFP 陽(yáng)性的細(xì)胞表現(xiàn)出遷移神經(jīng)元典型的雙極形態(tài)特征，具有卵圓形的胞體、一條長(zhǎng)、粗的頂突起伸向軟腦膜和一條短、細(xì)的尾突起伸向側(cè)腦室(圖3 A 插圖)。一些GFP 陽(yáng)性的細(xì)胞已經(jīng)到達(dá)CP 的淺層區(qū)域，并且它們的頂突起非常接近或已經(jīng)侵入MZ 中(圖3A，A')。轉(zhuǎn)染5 d 后(P1)檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大部分GFP 陽(yáng)性細(xì)胞聚集于MZ 的邊緣，并形成一條致密的帶。它們向MZ 中伸出一些小的分枝(圖3B，B')。GFP 標(biāo)記出的細(xì)胞的形態(tài)暗示出它們是神經(jīng)元。

為了證實(shí)這些被GFP 標(biāo)記的細(xì)胞確實(shí)是神經(jīng)元我們進(jìn)行了雙皮質(zhì)素(Doublecortin，DCX)免疫組化染色。DCX 是一種微管相關(guān)蛋白，被普遍認(rèn)為是有絲分裂后遷移神經(jīng)元的標(biāo)記物［10，11］，即能顯示出該神經(jīng)元未成熟的特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在電擊轉(zhuǎn)染后第3 天檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在大腦皮質(zhì)的CP 中大部分GFP 陽(yáng)性細(xì)胞都是DCX 陽(yáng)性的(圖3D)，表明在E15.5 用GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，且在3 d 或是更長(zhǎng)時(shí)間后在大腦皮質(zhì)中標(biāo)記出的細(xì)胞的確是神經(jīng)元。

2.3 搖晃蛋白引起神經(jīng)元產(chǎn)生分枝促進(jìn)樹(shù)突發(fā)育 已有研究表明，當(dāng)遷移神經(jīng)元的頂突起接觸到CP-MZ 的邊界線時(shí)，遷移神經(jīng)元便將其遷移方式由依賴(lài)膠質(zhì)細(xì)胞的整體運(yùn)動(dòng)式遷移轉(zhuǎn)變成胞體位移式遷移的方式，以完成最終的遷移過(guò)程。為了研究搖晃蛋白在這一過(guò)程中的作用，將遷移神經(jīng)元按照其所處位置分成兩類(lèi):(1)在皮質(zhì)板中遷移的神經(jīng)元，神經(jīng)元的胞體和頂突起都位于大腦皮質(zhì)板中(圖4A);(2)已接觸到搖晃蛋白的遷移神經(jīng)元，神經(jīng)元的胞體接近或接觸到CP-MZ 交界線且其頂突起已經(jīng)接觸到搖晃蛋白豐富的MZ 區(qū)(圖4B)。為了方便統(tǒng)計(jì)，利用Neuromantic 軟件對(duì)每組中典型的神經(jīng)元進(jìn)行示蹤，并畫(huà)出其模式圖(圖4C)。

研究發(fā)現(xiàn)，頂突起接觸到搖晃蛋白豐富的MZ區(qū)域的神經(jīng)元和頂突起仍在大腦皮質(zhì)板中的神經(jīng)元在突起的分枝程度上有明顯的差異。在大腦皮質(zhì)板中仍然進(jìn)行整體運(yùn)動(dòng)式遷移的神經(jīng)元的頂突起朝向MZ 區(qū)，并沒(méi)有出現(xiàn)分枝(圖4A)，而當(dāng)遷移神經(jīng)元的頂突起剛接觸到搖晃蛋白豐富的MZ 區(qū)域時(shí)，頂突起的末端開(kāi)始出現(xiàn)分枝，并且隨著遷移神經(jīng)元繼續(xù)向上遷移，胞體離搖晃蛋白豐富的MZ 區(qū)域越近，頂突起的長(zhǎng)度越來(lái)越短，此時(shí)，頂突起上的分枝數(shù)目越來(lái)越多(圖4 B、D)。遷移神經(jīng)元的胞體最終會(huì)停留在大腦皮質(zhì)板的最上端而不侵入搖晃蛋白豐富的MZ 區(qū)域中，此時(shí)，神經(jīng)元的頂突起完全消失，出現(xiàn)了大量的、繁茂的樹(shù)枝狀的突起。

為了對(duì)比位于大腦皮質(zhì)板中的神經(jīng)元和頂突起接觸到MZ 區(qū)域的神經(jīng)元的形態(tài)特征，測(cè)量神經(jīng)元頂突起的長(zhǎng)度和其對(duì)應(yīng)的突起的長(zhǎng)度并且計(jì)數(shù)每一個(gè)神經(jīng)元的頂樹(shù)突上的分枝點(diǎn)數(shù)。大腦皮質(zhì)板中遷移神經(jīng)元的頂突起的長(zhǎng)度為(65.73±10.88)μm。隨著神經(jīng)元向上遷移，剩余頂突起的長(zhǎng)度越來(lái)越短，神經(jīng)元頂樹(shù)突上的分枝的長(zhǎng)度越來(lái)越長(zhǎng)且分枝點(diǎn)越來(lái)越多。定量分析結(jié)果顯示，神經(jīng)元的剩余頂突起的長(zhǎng)度與總的分枝長(zhǎng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)(n=42，r=-0.700，P=2.44E-7;圖4D)，且與分枝點(diǎn)的數(shù)目呈極顯著負(fù)相關(guān)(n=39，r=-0.701，P=2.28E-7;圖4E)。

3 討論

3.1 搖晃蛋白促進(jìn)神經(jīng)元分枝在神經(jīng)元遷移中的作用 利用胚胎大腦皮質(zhì)腦片培養(yǎng)方法來(lái)研究神經(jīng)元遷移模型［12］，在頂突起(平均長(zhǎng)度為30～50μm)接觸到MZ 后，胞體運(yùn)動(dòng)的方式由跳躍性轉(zhuǎn)向連續(xù)性，并且胞體遷移的平均速度由35 μm/h 增加到60 μm/h。遷移神經(jīng)元的頂突起一旦接觸到搖晃蛋白豐富的MZ，頂突起便開(kāi)始產(chǎn)生初生的分枝，神經(jīng)元的遷移方式也會(huì)轉(zhuǎn)變成胞體位移式遷移的形式，這種遷移方式是不依賴(lài)于放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的［12］。在這個(gè)過(guò)程中，頂突起越來(lái)越短，在搖晃蛋白豐富的MZ 中的分枝越來(lái)越多，遷移神經(jīng)元的胞體也得以快速向上繼續(xù)遷移，這種遷移的動(dòng)力可能來(lái)自于搖晃蛋白引起的神經(jīng)元頂突起的快速的形態(tài)學(xué)改變而產(chǎn)生的向上的牽引拉力。一方面，這些分枝可以錨定在MZ 中，提供這種類(lèi)似“引體向上”式的牽引力，為神經(jīng)元最后通過(guò)胞體位移式遷移到達(dá)最終位置提供動(dòng)力;另一方面，當(dāng)遷移神經(jīng)元的胞體到達(dá)被細(xì)胞外基質(zhì)中搖晃蛋白包圍著的初級(jí)分枝點(diǎn)時(shí)，分枝點(diǎn)阻止了神經(jīng)元細(xì)胞核在頂突起中向上移動(dòng)，因此神經(jīng)元停止遷移。搖晃蛋白引起的頂突起的分枝便起到了終止信號(hào)的作用。

3.2 搖晃蛋白對(duì)神經(jīng)元的樹(shù)突發(fā)育的影響 在本研究中，使用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染方法成功將GFP 標(biāo)記并追蹤正在遷移的神經(jīng)元，這就使得在體觀察到神經(jīng)元在不同的發(fā)育階段時(shí)的形態(tài)特征成為可能。結(jié)合搖晃蛋白免疫組化染色，神經(jīng)元在搖晃蛋白陽(yáng)性的MZ 區(qū)出現(xiàn)分枝，可以推論搖晃蛋白促進(jìn)神經(jīng)元產(chǎn)生分枝。

之前的研究表明，純合子搖晃小鼠中除了皮層反轉(zhuǎn)外，另外一個(gè)顯著的特征是頂突起和樹(shù)突發(fā)育受損，朝向紊亂，放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的突起發(fā)育異常［7］。雜合子搖晃小鼠中沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞層紊亂，但是樹(shù)突發(fā)育仍受到影響［9］，說(shuō)明搖晃蛋白本身可能影響樹(shù)突的發(fā)育。將重組的搖晃蛋白加到培養(yǎng)基中后可以促進(jìn)純合子搖晃小鼠海馬神經(jīng)元的樹(shù)突的生長(zhǎng)［7］。以前有報(bào)道表明搖晃蛋白在大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元的樹(shù)突棘周?chē)募?xì)胞外基質(zhì)中聚集［13］，在雜合子搖晃小鼠中細(xì)胞層并沒(méi)有出現(xiàn)異位的情況下小棘的密度仍然減少了，說(shuō)明搖晃蛋白可以調(diào)節(jié)生后小鼠樹(shù)突的發(fā)育［14］。另外，搖晃蛋白可以促進(jìn)海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘的發(fā)育，使其變得過(guò)度肥大［15］。綜上所述，表明搖晃蛋白可以直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元的分枝和樹(shù)突的發(fā)育。

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