汪君民 龔騰云 (南通大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，南通 226007)

視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)主要是由脂肪細(xì)胞分泌的，是一種特異性結(jié)合視黃醇的蛋白質(zhì)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，RBP4 這一脂肪因子會(huì)導(dǎo)致胰島素抗性，在胰島素抗性發(fā)展中起到一個(gè)關(guān)鍵作用，在具有胰島素抗性的小鼠體內(nèi)及肥胖、2 型糖尿病病人體內(nèi)，血清RBP4 的水平升高［2］。升高的RBP4 水平與心血管危險(xiǎn)因子關(guān)系密切，并且可用來(lái)作胰島素抵抗程度的評(píng)價(jià)［3］。研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低不同年齡階段的研究對(duì)象的RBP4 水平［3，4］，提示運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)RBP4 水平的降低來(lái)提高胰島素的敏感性。

糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但最近炎癥學(xué)說(shuō)頗受關(guān)注，認(rèn)為炎癥在其發(fā)病機(jī)制中起重要的媒介作用。其中多種細(xì)胞因子包括許多白細(xì)胞介素介導(dǎo)了此類(lèi)反應(yīng)。白細(xì)胞介素通過(guò)自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌的方式加速或者抑制此類(lèi)炎癥反應(yīng)的過(guò)程。而其中的IL-2 與糖尿病的發(fā)病和進(jìn)程，以及與糖尿病相關(guān)的心血管疾病的關(guān)系最為密切，并且IL-2 還具有炎癥和免疫系統(tǒng)之外的重要調(diào)節(jié)作用，如通過(guò)全身給藥IL-2 能阻止非肥胖糖尿病小鼠的病程［5］等。而在胰島素抵抗情況下，運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致IL-2 及其受體水平如何變化目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本文采用重組RBP4 注射活體大鼠，獲得高RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型，觀察運(yùn)動(dòng)后胰島素抵抗和大鼠胸腺凋亡及免疫指標(biāo)變化，為臨床控制胰島素抵抗及糖尿病預(yù)防提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 胰島素(Sigma-Aldrich)、2-Deoxy-D-［I-3H］-glucose(Sigma-Aldrich)，RBP4 ELISA 試劑盒(Biosource)，胰島素放射免疫試劑盒(Biogenesis)，重組RBP4(Alexis)，IL-2、IL-2R 定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G250 蛋白測(cè)定試劑盒、凋亡細(xì)胞試劑盒均購(gòu)自廈門(mén)慧嘉生物技術(shù)公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)等儀器。

1.2 方法

1.2.1 重組RBP4 注射與運(yùn)動(dòng)方案 雄性SD 大鼠8 周齡22 只，體重183～211 g，隨機(jī)分成RBP4 +運(yùn)動(dòng)組(RE)10 只、RBP4 安靜組(RR)6 只，2 組大鼠給予重組RBP4 腹腔注射［2］，3 μg/g 體重，每12 h一次，持續(xù)注射4 周。其余6 只為安靜對(duì)照組(C)。RE 組大鼠按照Ploug 方法［6］進(jìn)行游泳訓(xùn)練4 周，泳池為直徑53 cm 內(nèi)壁光滑的塑料桶，水深70 cm，水溫為35±2℃，游泳訓(xùn)練開(kāi)始時(shí)間為晚上6 點(diǎn);大鼠先進(jìn)行每天15 min 適應(yīng)性游泳訓(xùn)練共2 天，從第3天開(kāi)始采取每天無(wú)負(fù)重游泳，每次持續(xù)60 min，每周訓(xùn)練6 天，周日休息，共持續(xù)4 周。訓(xùn)練中，大鼠如出現(xiàn)反復(fù)下沉或溺水傾向，及時(shí)撈出，休息后片刻，再投入水中，直至補(bǔ)足60 min 訓(xùn)練時(shí)間;同時(shí)使用小木棍及時(shí)驅(qū)趕，使大鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)，避免其出現(xiàn)抱團(tuán)、漂浮等現(xiàn)象，保證訓(xùn)練效果。將安靜對(duì)照組大鼠在浸水后撈出。游泳結(jié)束后撈出，以干毛巾擦拭，暖風(fēng)機(jī)吹干。

1.2.2 血清RBP4 和胰島素抵抗指數(shù)的檢測(cè) 采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定RBP4;采用放射免疫分析法測(cè)定胰島素。采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法評(píng)價(jià)胰島素敏感性，其原理是:假設(shè)外周組織和肝臟的胰島素抵抗相等，按胰島素和血葡萄糖在周?chē)M織、肝和胰腺等相互影響而建立起來(lái)的數(shù)學(xué)模型。計(jì)算公式為［7］:HOMA-IR(胰島素抵抗指數(shù))=空腹胰島素(國(guó)際單位/L)×以空腹葡萄糖(mmoL/L)/22.5。胰島素抵抗程度評(píng)估參照謝鐵男［8］等人的計(jì)算方法。

1.2.3 胸腺細(xì)胞凋亡光鏡觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死動(dòng)物，取出胸腺進(jìn)行凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記及觀察。采用TUNEL 方法［9］:將制備的胸腺組織石蠟切片脫蠟、乙醇水化，PBS 沖洗后蛋白酶K 消化，TDT 酶/生物素-dUTP 反應(yīng)液等處理(具體步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)，最后二甲苯透明，樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察結(jié)果并攝像。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為核呈棕紅色、背景清晰。

1.2.4 IL-2、IL-2R 指標(biāo)檢測(cè) 外周血中IL-2、IL-2R 的含量檢測(cè)用ELISA 法，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.5 大鼠血清中GM-CSF 水平檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法。用抗鼠GM-CSF 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的GM-CSF 與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人GM-CSF，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin 與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm 處測(cè)OD 值，GMCSF 濃度與OD 值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出標(biāo)本中GM-CSF 濃度。

1.2.6 胸腺及脾臟指數(shù) 用分析天平稱(chēng)取胸腺及脾臟重量后，計(jì)算依據(jù)下列公式:胸腺(或脾臟)指數(shù)(g/100g)=100 ×胸腺(或脾臟)重量/體重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0 程序處理，以x-±s 表示，Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，組間進(jìn)行方差分析，采用LSD 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清RBP4 和胰島素抵抗指數(shù)變化 4 周后，RE 組和RR 組大鼠血清RBP4 水平顯著高于C 組(P ＜0.01);RE 組大鼠血清RBP4 水平顯著低于RR 組(P ＜0.01);RE 組和RR 組大鼠HOMA-IR 顯著高于C 組(P ＜0.01);RE 組大鼠HOMA-IR 顯著低于RR 組(P ＜0.01，見(jiàn)表1。

2.2 觀察大鼠胸腺細(xì)胞凋亡的數(shù)量及分布部位 見(jiàn)圖1。正常安靜對(duì)照組(C):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位均可見(jiàn)被染成棕紅色的凋亡細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)胸腺細(xì)胞比例較少。

RBP4 安靜組(RR):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見(jiàn)棕紅色的凋亡細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增多，陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)胸腺細(xì)胞的比例增大。RBP4 +運(yùn)動(dòng)組(RE):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見(jiàn)棕紅色的凋亡細(xì)胞較正常安靜對(duì)照組增多，但較RBP4安靜組明顯減少。

2.3 外周血中IL-2、IL-2R 的表達(dá)變化 4 周后，RR 組和C 組大鼠外周血IL-2、IL-2R 表達(dá)差異不大;RE 組大鼠外周血IL-2 表達(dá)高于RR 組(P ＜0.05)，而IL-2R 表達(dá)明顯低于RR 組(P ＜0.05);其比值高于RR 組(P ＜0.01)。見(jiàn)表2。

2.4 大鼠血清中GM-CSF 水平變化 4 周后，RR組和C 組大鼠外周血GM-CSF 水平相比明顯增加，且具有顯著差異性(P ＜0.01)，同時(shí)RE 組和C 組比較則沒(méi)有顯著性差異。見(jiàn)表3。

2.5 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化 4 周后，RR 組與C 組大鼠相比，體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)都有所下降(P ＜0.05);而RE 組與C 組大鼠相比體重?zé)o顯著差異，與RR 組比較胸腺指數(shù)(P ＜0.05)、脾臟指數(shù)明顯提高(P ＜0.01)。見(jiàn)表4。

表1 血清RBP4 和胰島素抵抗指數(shù)變化Tab.1 Changes in serum RBP4 and HOMA-IR of rats

表2 外周血中IL-2、IL-2R 的表達(dá)變化Tab.2 Changes of IL-2 and IL-2R expression

表3 大鼠血清中GM-CSF 水平Tab.3 Changes GM-CSF in serum of rats

表4 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化Tab.4 Changes of weight，thymus index and spleen index of rats

圖1 各組胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)光鏡下細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Changes in thymus cortex and medulla of apoptosis

3 討論

3.1 大鼠血清RBP4 變化情況 胰島素抵抗不僅是2 型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，還是代謝綜合征(糖尿病、肥胖、高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病)的共同病理基礎(chǔ)。胰島素能夠提高組織對(duì)葡萄糖的攝取率，機(jī)制是胰島素與靶細(xì)胞的胰島素信號(hào)蛋白相互作用，最終能夠增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體從細(xì)胞內(nèi)池向細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)［10］。胰島素在不同的組織、細(xì)胞中通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大作用發(fā)揮不同的生理作用。本研究中大鼠經(jīng)過(guò)RBP4 注射4 周后，與C 組相比，RE 組和RR 組大鼠均出現(xiàn)胰島素抵抗;對(duì)RBP4 注射后的大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，雖然大鼠血清RBP4 水平仍高于C 組，但與RR 組比較胰島素抵抗指數(shù)明顯下降。與此對(duì)應(yīng)的是:RE 組和RR 組大鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著高于C 組，RE 組大鼠明顯低于RR 組。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)能夠抵抗RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

3.2 光鏡觀察結(jié)果分析 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)又稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡。是一種不同于壞死的、由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡形式。細(xì)胞凋亡與免疫細(xì)胞的發(fā)育分化及行使功能等各個(gè)方面有密切的聯(lián)系。有研究［11］指出:創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠胸腺細(xì)胞凋亡增多明顯，同時(shí)其增殖能力降低，并且凋亡的細(xì)胞主要集中于胸腺依賴(lài)區(qū)的淋巴細(xì)胞，即T 細(xì)胞。探討運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗大鼠免疫細(xì)胞凋亡的影響，有助于胰島素抵抗和糖尿病人群尋求更好的運(yùn)動(dòng)方式減輕胰島素抵抗帶來(lái)的免疫力的下降，提高患者的生活質(zhì)量。

本研究結(jié)果顯示:運(yùn)動(dòng)+RBP4 組在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見(jiàn)棕紅色的凋亡細(xì)胞較正常安靜對(duì)照組增多，但較RBP4 安靜組明顯減少。結(jié)果提示，RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗不僅能影響外周成熟的T淋巴細(xì)胞功能，而且能影響中樞免疫器官中未成熟的淋巴細(xì)胞，胸腺細(xì)胞在發(fā)育成熟過(guò)程中凋亡增多，進(jìn)而可能導(dǎo)致進(jìn)入外周血循環(huán)中的成熟T 細(xì)胞減少，免疫力降低。本研究說(shuō)明運(yùn)動(dòng)對(duì)RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠胸腺細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，可以增強(qiáng)胰島素抵抗大鼠的免疫力。

3.3 大鼠外周血IL-2 及IL-2R 表達(dá)變化情況 IL-2 是由Th 細(xì)胞IL 抗原或絲裂原刺激下和IL-1 誘導(dǎo)下分泌的一種15 kD 的糖蛋白，能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂，增強(qiáng)殺傷細(xì)胞的殺傷功能和輔助抗體生成等，在機(jī)體的免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)中起著重要的作用。血清IL-2 水平是末梢血單核細(xì)胞功能的一個(gè)敏感而又量化的指標(biāo)，其生物學(xué)作用是通過(guò)和靶細(xì)胞上特異性高親和力的IL-2R 相互作用來(lái)完成的。白細(xì)胞介素2 受體有兩種，即存在于細(xì)胞表面的IL-2 膜受體(mIL-2R)和存在于體液中的可溶性IL-2 受體(IL-2R)，這兩種受體都可結(jié)合IL-2，中和活化T 細(xì)胞周?chē)^(guò)多的白介素2，具有免疫調(diào)控作用。IL-2具有增強(qiáng)荷瘤機(jī)體免疫功能的作用［12］。錢(qián)令波等［5］研究表明:IL-2 對(duì)大鼠的心臟收縮功能具有明顯抑制作用;可明顯改善糖尿病(高葡萄糖濃度)誘發(fā)的血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能減弱;可減弱高葡萄糖濃度誘發(fā)的冠狀動(dòng)脈血管阻力的升高。

本研究結(jié)果表明，RE 組與RR 組大鼠血清IL-2表達(dá)升高、IL-2R 表達(dá)降低(P ＜0.05)，且IL-2/IL-2R 比值明顯增大(P ＜0.01)，其升高機(jī)理可能是4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作用于激活的T 淋巴細(xì)胞，使其對(duì)IL-2R 表達(dá)與釋放減少，而IL-2R 可結(jié)合血清中的IL-2，具有免疫抑制作用。結(jié)合錢(qián)令波［5］的研究結(jié)果，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)不但能夠改善胰島素抵抗大鼠的免疫機(jī)能，而且能夠改善心臟舒張功能，減弱冠狀動(dòng)脈血管阻力的升高，為胰島素抵抗患者提供了鍛煉預(yù)防糖尿病的科學(xué)依據(jù)。

3.4 大鼠血清中GM-CSF 水平變化 GM-CSF 是一種來(lái)源于T、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的一種糖蛋白，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中由損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一種多肽類(lèi)激素樣造血生長(zhǎng)因子，它可促進(jìn)造血祖細(xì)胞分化成單核巨噬細(xì)胞，并維持單核巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化，為炎癥反應(yīng)的敏感的標(biāo)志物［13］。它可刺激骨髓早期母細(xì)胞分化，并促進(jìn)這些細(xì)胞的成熟和增殖，對(duì)機(jī)體的免疫、抗感染、造血能力具有重要的調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用。是聯(lián)系生物體內(nèi)三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要介質(zhì)。它可通過(guò)影響網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，引起免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂，特別是表現(xiàn)在T、B 細(xì)胞比例發(fā)生紊亂，使CD4/CD8 比值發(fā)生改變［14］。

本文結(jié)果表明，RR 組血清中GM-CSF 水平非常顯著地高于正常安靜對(duì)照組(P ＜0.01)，而RE 則與正常安靜對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，這一結(jié)果表明，血清GM-CSF 確實(shí)與胰島素抵抗發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。其升高的機(jī)理有可能是:由于RBP4 引起的大鼠胰島素抵抗導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能受到抑制，大鼠機(jī)體存在非特異性免疫調(diào)控增強(qiáng)之故。但具體是由于過(guò)度活化的T 細(xì)胞分泌增加所致，還是其他因子分泌增加所致，抑或是骨髓干細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞異常分泌增加所致尚需深入研究。RE 組血清中GM-CSF 水平變化不具顯著性，可能是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練部分恢復(fù)了細(xì)胞免疫功能，從而抵消了RBP4 引起的胰島素抵抗，其具體機(jī)理需要進(jìn)一步探索。

3.5 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)組間關(guān)系 胸腺為中樞免疫器官，是T 淋巴細(xì)胞發(fā)育及成熟的場(chǎng)所。脾是人體最大的外周免疫器官，B 淋巴細(xì)胞在此發(fā)育、成熟，脾也是機(jī)體在抗原刺激下發(fā)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所。因此胸腺、脾臟結(jié)構(gòu)的衰退和功能下降勢(shì)必會(huì)影響機(jī)體的體液、細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)。胸腺指數(shù)和脾指數(shù)是依據(jù)機(jī)體體重來(lái)計(jì)算的，是直接反映胸腺、脾免疫功能的重要指標(biāo)［15］，二者的高低變化反映了機(jī)體體內(nèi)免疫功能的狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RR 組大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于正常安靜對(duì)照組C 組，表明RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠體重胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯降低。而RE 組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于RR 組，則說(shuō)明耐力運(yùn)動(dòng)能顯著提高模型大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，提高機(jī)體體液、細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)防病抗病能力。

總之，RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠免疫功能有所下降，具體表現(xiàn)為:與對(duì)照組(C)相比，RBP4 誘導(dǎo)組的HOMA-IR、胸腺的凋亡細(xì)胞、血清IL-2、IL-2R 的表達(dá)及血清GM-CSF 分別發(fā)生改變;運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠下降的免疫功能部分恢復(fù)，具體表現(xiàn)為:與對(duì)照組(RR)相比，RBP4誘導(dǎo)組的HOMA-IR、胸腺的凋亡細(xì)胞、血清IL-2、IL-2R 的表達(dá)及血清GM-CSF 分別發(fā)生改變。

3.6 研究缺陷和進(jìn)一步研究的方向 本試驗(yàn)只采用了游泳這種單一的練習(xí)方式，沒(méi)有設(shè)置專(zhuān)門(mén)的力量練習(xí)組。而有文獻(xiàn)認(rèn)為，適當(dāng)?shù)牧α炕蚩棺枇Ψ桨冈O(shè)計(jì)對(duì)不適合進(jìn)行走、慢跑、有氧健身操等練習(xí)的2 型糖尿病患者是可行而且有效的［16］。

缺乏胸腺細(xì)胞凋亡的定量研究，RBP4 與血清GM-CSF、IL-2 等之間的關(guān)系沒(méi)有進(jìn)一步探討，也是以后研究的方向。

運(yùn)動(dòng)能夠明顯提升RBP4 誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠胸腺細(xì)胞抗凋亡能力和免疫能力。該研究在探討胰島素抵抗患者免疫功能紊亂的發(fā)生機(jī)制和臨床治療方面有所啟示。

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