DC 對(duì)系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染保護(hù)性研究①

徐美蘭 劉金星 陳美任 (嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，梅州 514031)

近年來白假絲酵母菌在醫(yī)院感染中成為最常見的條件致病性真菌。臨床上隨著體內(nèi)治療裝置的植入及器官移植等使白假絲酵母菌感染率不斷上升，深部白假絲酵母菌感染病死率高達(dá)40%［1-3］。其主要原因是目前用于治療真菌的藥物數(shù)量有限且部分真菌已產(chǎn)生耐藥。所以研發(fā)有效的疫苗對(duì)白假絲酵母菌感染防治具有重要意義。

DC 作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞(APC)，其表面多樣性的受體是其識(shí)別并捕捉各種形態(tài)真菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有強(qiáng)大的提呈抗原作用和啟動(dòng)初始T 細(xì)胞的能力。DC 通過細(xì)胞表面的甘露糖-巖藻糖等受體［4］，識(shí)別和吞噬念珠菌，然后到達(dá)組織引流次級(jí)淋巴器官，分化成成熟的DC，從而有效地啟動(dòng)T 細(xì)胞增殖和分化。

在系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染過程中，體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答都發(fā)揮了重要的防御作用。本課題組將致敏的DC 免疫小鼠，觀察其對(duì)系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的保護(hù)效果的研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14053(均由本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存)。KM 系小鼠:5～6 周齡約30 g，購(gòu)于汕頭大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào):SCXK2012-0017)。小鼠DC2.4 細(xì)胞(DC 細(xì)胞來源于小鼠骨髓)、IL-4、IFN-αmouse ELISA 試劑均購(gòu)于上海希爾頓有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白假絲酵母菌孢子與菌絲混合液致敏小鼠DC 白假絲酵母菌于沙堡培養(yǎng)基純培養(yǎng)48 h，菌液濃度調(diào)至5 ×105ml-1;取沙堡培養(yǎng)基上白假絲酵母菌轉(zhuǎn)種于YPD 液體培養(yǎng)基，置搖床振蕩培養(yǎng)48 h，離心棄上清，加入含小牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基，調(diào)菌數(shù)為5 ×105ml-1，置37℃水浴箱培養(yǎng)3 h，得菌絲相白假絲酵母菌［5］。將上述白假絲酵母菌孢子液與菌絲液相等量混合，以2 倍于DC數(shù)的白假絲酵母菌孢子混合液與小鼠DC 混合，37℃孵育1 h，牛血清白蛋白梯度離心后收集分界層細(xì)胞［6］，PBS 洗滌2 次，調(diào)DC 濃度為1 ×106ml-1置于冰浴上。每次取100 μl 小鼠尾靜脈注射。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為2 組，每組10 只。DC 組為預(yù)處理DC 100 μl 與福氏完全佐劑等體積混合物，分別于第1 天、第7 天及第14 天經(jīng)尾靜脈注射，對(duì)照組注射等量PBS。環(huán)磷酰胺具有免疫抑制作用，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)得80 mg/kg 造系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠模型效果較佳。免疫接種后各組小鼠接受免疫抑制劑給予環(huán)磷酰胺80 mg/kg，背部皮下注射，連續(xù)2 d;再用菌量為0.2 ml×106ml-1的白假絲酵母菌孢子及菌絲混懸液經(jīng)尾靜脈注射形成系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染動(dòng)物模型［7］，觀察小鼠生存期、腎臟做病理切片，眼球取血送廣州華銀檢驗(yàn)中心檢測(cè)CD4+、CD8+，取血清按試劑說明書檢測(cè)IL-4 及IFN 水平。

2 結(jié)果

2.1 生存期及CD4+、CD8+、IL-4、IFN-α 檢測(cè) 對(duì)照組小鼠第1 天(d)死亡2 只，至第3 d 內(nèi)全部死亡;DC 組3 d 死亡1 只，第7 天死亡4 只，其余存活至觀察期結(jié)束。經(jīng)Kaplan-Meier 分析，對(duì)照組和DC組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，詳見表1。

2.2 小鼠腎病理切片 DC 組腎小球輕度水腫，鏡下可見少量白細(xì)胞及紅細(xì)胞，未見管型;對(duì)照組水腫充血較明顯，鏡下可見大量紅細(xì)胞、白細(xì)胞，可見白細(xì)胞管型，腎小球結(jié)構(gòu)不完整。詳見圖2。

表1 小鼠生存時(shí)間與生存狀況及CD4 +、CD8 +百分比，白細(xì)胞介素4，干擾素α 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.1 Analysis of survival time and living condition of mouse，percentage of CD4 +CD8 +and IL-4，IFN-α

圖1 CD4 +CD8 +流式檢測(cè)結(jié)果Fig.1 FCM result of CD4 +CD8 +

圖2 小鼠腎病理切片F(xiàn)ig.2 Kidney pathological section of mouse

3 討論

白假絲酵母菌是二相性真菌，其孢子和菌絲相致病力及侵襲力各不相同，因此本試驗(yàn)采用兩者的混合液致敏小鼠DC。DC 對(duì)雙相白假絲酵母菌具有極強(qiáng)的可塑性，可以識(shí)別不同形態(tài)、不同表面標(biāo)志而表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性［9］。在念珠菌感染中，不同狀態(tài)的白假絲酵母菌能夠以不同途徑進(jìn)入DC［10］。酵母狀態(tài)的白色念珠菌被吞噬后，在細(xì)胞內(nèi)形成吞噬溶酶體，DC 分泌NO 和IL-12，調(diào)節(jié)CD4+Th 細(xì)胞向Th1 型分化，在體內(nèi)產(chǎn)生有效的抗真菌反應(yīng);而菌絲體狀態(tài)的白色念珠菌通過傳統(tǒng)的拉鏈途徑被吞噬入胞，會(huì)裂解體膜，躲避在細(xì)胞漿中。本實(shí)驗(yàn)將致敏的DC 接種免疫小鼠，當(dāng)DC 在小鼠體內(nèi)再次接觸白假絲酵母菌根據(jù)“免疫記憶”可迅速進(jìn)行免疫應(yīng)答反應(yīng)。

DC 在抗感染免疫中的作用十分獨(dú)特，其既是固有免疫的第一道防線(識(shí)別、吞噬)，又是獲得性免疫的始動(dòng)者(對(duì)不同免疫方向的誘導(dǎo))，主要誘導(dǎo)CD4+T(Th1、Th2)和CD8+T 淋巴細(xì)胞的活化［10-12］。機(jī)體抗白念珠菌的免疫機(jī)制包括固有免疫和獲得性免疫，因此，應(yīng)選擇既能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫又能誘導(dǎo)體液免疫的物質(zhì)作為候選疫苗。本項(xiàng)目中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的生存期有顯著性差異，說明DC 在抵抗系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染發(fā)揮著重要的作用，這與小鼠腎病理切片觀察結(jié)果相符，即DC 能有效保護(hù)白假絲酵母菌對(duì)小鼠腎小球的損傷。CD4+T 細(xì)胞是MHCⅡ類抗原限制的細(xì)胞群，CD8+T 細(xì)胞是MHCⅠ類抗原限制的細(xì)胞群。無論CD4+還是CD8+T 細(xì)胞均具有增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞免疫功能。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CD4+、CD8+相比均顯著性升高，說明致敏的DC對(duì)系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染誘發(fā)了有效而足夠的保護(hù)性免疫反應(yīng)。與自然免疫比較，體外抗原致敏后的人工過繼免疫能避免抗原與抗原提呈細(xì)胞相遇機(jī)遇小、誘發(fā)免疫的方向難以控制的不足。

根據(jù)CD4+Th 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的類型，可分為Th1 和Th2 兩個(gè)亞群。CD4+Th 通過分泌細(xì)胞因子，移動(dòng)和活化效應(yīng)細(xì)胞和分子。在系統(tǒng)性真菌感染中T 淋巴輔助細(xì)胞1(Th1)類因子如白細(xì)胞介素(IL-12)、干擾素α(IFN-α)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，而Th2 類細(xì)胞因子如IL-4、IL-10 等可削弱小鼠抗系統(tǒng)性真菌感染的能力［13］。IFN-α 既可作為前炎因子誘導(dǎo)IL-12 的分泌，促進(jìn)Th0 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞的定向分化;又可作為效應(yīng)因子，活化巨噬細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞，促進(jìn)單核細(xì)胞的循環(huán)，是機(jī)體抗白念珠菌感染的保護(hù)性因子。在本實(shí)驗(yàn)中IFN-α 水平的高低是致敏DC 誘導(dǎo)小鼠抗系統(tǒng)性白假絲酵母菌免疫的重要指標(biāo)，IL-4 的水平作為小鼠白念珠菌感染非保護(hù)性免疫的指標(biāo)。結(jié)果顯示致敏DC 組IFN-α 含量較菌絲相組及對(duì)照組明顯增高，IL-4 含量變化則與之相反。再次證明了致敏DC 對(duì)系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的免疫保護(hù)價(jià)值。有理由相信隨著相關(guān)研究的不斷深入，DC 疫苗或以DC 為佐劑將會(huì)在抗白假絲酵母菌感染免疫中起到越來越重要的作用。

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