易清清 譚 瑩 李 曰 杜 斌 馮 磊 邱麗穎 (江南大學(xué)藥學(xué)院，無(wú)錫214122)

現(xiàn)今治療腫瘤不僅注重治療效果，同時(shí)更注重機(jī)體的反應(yīng)性。對(duì)腫瘤及宿主雙方面因素綜合考慮，采用扶正與祛邪相結(jié)合，以增加和調(diào)動(dòng)機(jī)體自身抗癌能力，是當(dāng)前惡性腫瘤治療的一種常用的方法［1］。中醫(yī)藥的抗腫瘤療效顯著，毒副作用小，對(duì)腫瘤患者免疫調(diào)節(jié)作用具有明顯的優(yōu)勢(shì)［2］。中醫(yī)藥從調(diào)節(jié)免疫功能出發(fā)，配合化療可起到增效減毒作用，并改善患者低下的免疫功能。中醫(yī)治療中晚期惡性腫瘤以扶正培本為主，也是中醫(yī)治療惡性腫瘤的最大特色，而最突出的就是提高患者免疫功能，改善臨床癥狀和生存質(zhì)量，提高生存率［3］?！耙嬖至鰷笔桥R床的經(jīng)典驗(yàn)方，在無(wú)錫市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院已經(jīng)作為醫(yī)院制劑進(jìn)行臨床治療使用，對(duì)腫瘤病人作為輔助藥物治療效果顯著。本研究觀察“益元抑瘤湯”水煎液對(duì)H22荷瘤小鼠免疫功能的影響，為闡明該方的臨床應(yīng)用效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 PRMI1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司);脂多糖(LPS)、刀豆蛋白(Con A)、甲基偶氮唑鹽(MTT)、IL-2試劑盒、TNF-α 試劑盒、印度墨汁(北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(Sigma公司)。

1.2 受試藥的制備 根據(jù)無(wú)錫市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑制備工藝，取“益元抑瘤湯”一個(gè)處方量:黃芪20 g、合歡皮15 g、靈芝10 g、茯苓20 g、女貞子10 g、浙貝母10 g。加水1 020 ml，浸泡30 min，加熱煮沸兩次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液。濃縮，干燥，粉碎后備用。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解成所需濃度。

1.3 動(dòng)物模型的建立 H22小鼠肝癌細(xì)胞株(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理學(xué)研究室)，動(dòng)物腹腔內(nèi)接種傳代。腹腔接種H22腹水7 d的瘤源鼠脫頸處死，無(wú)菌抽取腹水，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用生理鹽水稀釋?zhuān){(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×107～3×107個(gè)/ml。取0.2 ml注入雌性ICR小鼠(上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)右腋皮下［4］。將接種的小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只:腫瘤對(duì)照組，陽(yáng)性參一膠囊(生產(chǎn)廠家:吉林亞泰制藥股份有限公司，批號(hào):20120502)組，“益元抑瘤湯”劑量組，另取未接種小鼠作為正常對(duì)照組。接種H22細(xì)胞后次日開(kāi)始給藥，連續(xù)灌胃給藥14天，每日給藥一次。每日給藥前記錄各組動(dòng)物的體重、飲食、毛發(fā)、活動(dòng)、精神狀態(tài)等體征。

1.4 藥物用量 正常對(duì)照組:生理鹽水0.1 ml/10 g體重;腫瘤對(duì)照組:蒸餾水0.1 ml/10 g體重;陽(yáng)性對(duì)照組:參一膠囊，按說(shuō)明書(shū)由人換算成小鼠給藥濃度為80 mg/ml/10 g體重;“益元抑瘤湯”組:醫(yī)院臨床用量為每日14.1 g，換算成小鼠給藥濃度為181.8 mg/ml/10 g體重。

1.5 小鼠血清IL-2、TNF-α含量的測(cè)定 給藥14 d后，實(shí)體瘤小鼠摘眼球取血0.5～1 ml，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取血清置于 -20℃保存，IL-2、TNF-α試劑盒測(cè)定。

1.6 小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定 給藥14 d后，脫頸處死動(dòng)物，75%酒精浸泡5 min，無(wú)菌取出脾臟，剪碎，再轉(zhuǎn)入5 ml玻璃勻漿器中仔細(xì)研磨，過(guò)200目細(xì)胞篩并制成細(xì)胞懸液，用PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次。再用完全培養(yǎng)液調(diào)濃度為5×106個(gè)/ml。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔100μl)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。每只小鼠脾細(xì)胞懸浮液分為3組，一組加5μl(濃度為0.1 mg/ml)Con A 液，一組加10 μl(濃度為0.1 mg/ml)LPS液，一組不做處理。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h，加入5 mg/ml的 MTT液10 μl，振搖，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加DMSO(每孔100μl)，振蕩，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)OD值。淋巴細(xì)胞的增殖能力分別用加Con A和LPS孔的光密度值減去不加Con A和LPS孔的光密度值表示。

1.7 小鼠巨噬細(xì)胞功能的測(cè)定 末次給藥后1 h，于鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁(生理鹽水稀釋3倍)0.1 ml/10 g，注射后 2 min、10 min 分別從小鼠的左眼靜脈叢和右眼靜脈叢取血20μl，加入0.1%Na2CO3溶液 2.0 ml中，搖勻，以 0.1%Na2CO3溶液做空白對(duì)照。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)600 nm下比色，測(cè)定其OD值。將小鼠稱(chēng)重，處死，取肝、脾稱(chēng)重，按下列公式計(jì)算出碳廓清指數(shù)κ和吞噬系數(shù)α:κ=(logOD1-logOD2)/(t1-t2);α =κ1/3×W/WLS，式中OD1、OD2分別為 2 min、10 min 時(shí)，取血測(cè)得的吸光度值，t1、t2為注射印度墨汁后采血的時(shí)間，W為體重，WLS為肝+脾合重。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，多組均數(shù)比較用單因素方差分析。P＜0.01認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥期間各組動(dòng)物一般情況 結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 “益元抑瘤湯”對(duì)H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響 由表2可以看出，模型組和參一膠囊組的血清IL-2含量明顯低于正常組，而“益元抑瘤湯”組的血清IL-2含量顯著升高，與模型組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);模型組、參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組的血清TNF-α含量均明顯高于正常組，與模型組比較，參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組差異有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 “益元抑瘤湯”對(duì)H22荷瘤小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 由表3可知，模型組的T、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力均低于正常組，參一膠囊陽(yáng)性對(duì)照組和“益元抑瘤湯”組小鼠的T、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力均高于正常組，與模型組比較，參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 “益元抑瘤湯”對(duì)H 22荷瘤小鼠體重、精神的影響Tab.1 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on weight and mental state in H 22 tumor-burdened mice

表2 “益元抑瘤湯”對(duì)H 22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響(± s，n=10)Tab.2 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the contents of IL-2 and TNF-αin H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

表2 “益元抑瘤湯”對(duì)H 22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響(± s，n=10)Tab.2 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the contents of IL-2 and TNF-αin H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with normal control，3)P ＜ 0.01.

Group n IL-2(pg/ml) TNF-α(μg/ml)NC 10 82.71 ±13.01 1.12 ±0.13 MC 10 63.96 ±3.603) 1.45 ±0.173)Rg3 10 68.13 ±6.253) 1.67 ±0.231)3)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 80.62 ±12.502) 2.11 ±0.282)3)

表3 “益元抑瘤湯”對(duì)H22荷瘤小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響± s，n=10)Tab.3 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the T and B cell proliferation in H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

表3 “益元抑瘤湯”對(duì)H22荷瘤小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響± s，n=10)Tab.3 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the T and B cell proliferation in H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜ 0.01;Compared with normal control，2)P ＜0.05.

Group n T lymphocytes(OD) B lymphocytes(OD)NC 10 0.191 ±0.040 0.192 ±0.060 MC 10 0.155 ±0.0252) 0.158 ±0.014 Rg3 10 0.230 ±0.0111)2) 0.230 ±0.0111)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 0.217 ±0.0111) 0.223 ±0.0121)

表4 “益元抑瘤湯”對(duì)H 22荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響± s，n=10)Tab.4 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the function of macrophages in H 22 tumor-burdened mice±s，n=10)

表4 “益元抑瘤湯”對(duì)H 22荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響± s，n=10)Tab.4 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the function of macrophages in H 22 tumor-burdened mice±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with normal control，3)P ＜0.01.

Group n The carbon clearance index(κ)Predominate consume coefficient(α)NC 10 0.021 ±0.002 4.95 ±0.32 MC 10 0.027 ±0.0093) 4.89 ±0.18 Rg3 10 0.026 ±0.0063) 5.08 ±0.261)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 0.036 ±0.0091)3) 5.60 ±0.352)3)

2.4 “益元抑瘤湯”對(duì)H22荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響 由表4可以看出，模型組、參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組的碳廓清指數(shù)κ均顯著高于正常組，與模型組比較，“益元抑瘤湯”組差異有顯著性(P＜0.05);參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組的吞噬系數(shù)α均高于正常組，并且與模型組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3 討論

機(jī)體抗腫瘤的免疫機(jī)制十分復(fù)雜，抗腫瘤免疫效應(yīng)一般以細(xì)胞免疫為主，但對(duì)病毒誘發(fā)的腫瘤，體液免疫亦起到十分重要的作用。腫瘤的存在不僅抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫，同時(shí)也抑制體液免疫。因此，提高腫瘤患者的免疫功能，成為抗腫瘤治療的一個(gè)主要方面［5］。本文中“益元抑瘤湯”給藥期間小鼠體重增加均勻，飲食、飲水量正常，小鼠比較活躍，毛色有光澤，精神狀態(tài)良好，無(wú)明顯副作用，可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身的免疫功能，達(dá)到“帶瘤生存”的目的。

白細(xì)胞介素2(IL-2)是由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的多功能免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，其最重要的作用是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖(從G0期進(jìn)入S期)和分化。IL-2能增強(qiáng)CD8+、CTL的殺傷活性，誘導(dǎo)其IL-2受體的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)各效應(yīng)細(xì)胞分泌 IL-4、TNF、CSF等細(xì)胞因子［6］。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用特強(qiáng)的生物活性因子之一［7］。在本研究中，“益元抑瘤湯”能顯著升高H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量，說(shuō)明“益元抑瘤湯”通過(guò)增加H22荷瘤小鼠體內(nèi)IL-2、TNF-α的分泌促進(jìn)機(jī)體免疫。

T細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞毒的直接殺腫瘤作用而抑瘤，或者分泌與腫瘤有關(guān)的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2(IL-2)、干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)等，形成細(xì)胞因子網(wǎng)，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)外的因子之間與細(xì)胞間的相互作用，共同殺傷腫瘤細(xì)胞［8］。B細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞非依賴性細(xì)胞，在抗原刺激下可分化為漿細(xì)胞，合成和分泌免疫球蛋白，主要執(zhí)行機(jī)體的體液免疫。本實(shí)驗(yàn)表明:“益元抑瘤湯”組小鼠的T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力均顯著高于模型對(duì)照組，說(shuō)明“益元抑瘤湯”對(duì)H22荷瘤小鼠脾臟T、B細(xì)胞增殖均具有促進(jìn)作用。

巨噬細(xì)胞(M)是腫瘤免疫中的重要效應(yīng)細(xì)胞，它在誘導(dǎo)特異性體液免疫和細(xì)胞性抗腫瘤免疫應(yīng)答中占有重要地位，屬于非特異性免疫［9］。它可以通過(guò)直接吞噬外來(lái)抗原或直接與瘤細(xì)胞結(jié)合而發(fā)揮殺瘤效應(yīng);也可以分泌某些產(chǎn)物抑制腫瘤的生長(zhǎng);還可以通過(guò)ADCC作用殺傷腫瘤［10］?！耙嬖至鰷苯M的碳廓清指數(shù)κ和吞噬系數(shù)α均高于模型組，說(shuō)明“益元抑瘤湯”能促進(jìn)荷瘤機(jī)體免疫力的提高，可能通過(guò)以上某一途徑產(chǎn)生抑瘤作用。

綜上所述，“益元抑瘤湯”能增加H22荷瘤小鼠體內(nèi) IL-2、TNF-α 含量;對(duì)H22荷瘤小鼠脾臟 T、B 細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞的吞噬功能有明顯促進(jìn)作用?！耙嬖至鰷睂?duì)荷瘤機(jī)體的免疫系統(tǒng)的影響達(dá)到了扶正祛邪的目的，顯示了中醫(yī)治療腫瘤的特色，有利于腫瘤機(jī)體的恢復(fù)。

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