鞘氨醇激酶1 蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

易 敏 王 嶸 陳 璐 沈婷婷 宋連川 種生珍

(青海省第五人民醫(yī)院病理科，西寧 810007)

乳腺癌是最常見危害女性健康的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升及年輕化的趨勢(shì)，已躍居城市女性惡性腫瘤的首位，其中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(Breast invasive ductal carcinoma，BIDC)最常見，占乳腺癌70%左右［1，2］。細(xì)胞內(nèi)鞘氨醇1 磷酸鹽(Sphingosine 1-phosphate，S1P)水平與其代謝前體神經(jīng)酰胺和鞘氨醇之間的平衡被認(rèn)為是決定細(xì)胞增殖和死亡的開關(guān)［3］。鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase 1，SphK1)是調(diào)控這一平衡的決定性因素之一，其促進(jìn)代謝前體鞘氨醇生成S1P［4］。SphK1 活性可以被很多激動(dòng)劑(如生長(zhǎng)因子)快速激活，從而反映其在控制S1P 水平中發(fā)揮決定性作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)SphK1 在許多實(shí)體腫瘤中異常高表達(dá)，另外研究證實(shí)在乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中SphK1 高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，提示SphK1 在人類腫瘤中作為一個(gè)潛在促癌因子發(fā)揮功能［6］。本研究通過免疫組化檢測(cè)SphK1 蛋白在BIDC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析其與BIDC 臨床病理特征的關(guān)系，為臨床提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記和治療新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)收集本院病理科2008 年1 月至2012 年12 月保存的BIDC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣大于3 cm)手術(shù)切除標(biāo)本58 例，所有標(biāo)本經(jīng)病理確診及常規(guī)相關(guān)免疫組化染色。所有患者均為女性，年齡27～74 歲，平均(49±2.9)歲。臨床分期(AJCC，2003 年):Ⅰ+Ⅱ期37 例，Ⅲ+Ⅳ期21 例;病理分級(jí)(參照Elston 和Ellis 改良的Scarff-Bloom-Richardson 定量組織學(xué)分級(jí)法):Ⅰ級(jí)8 例，Ⅱ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)28 例;其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26 例。雌激素受體(Estrogen receptor，ER)陽性30 例，陰性28;孕激素受體(Progesterone receptor，PR)陽性26 例，陰性32;人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)陽性10 例，陰性48 例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 根據(jù)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的免疫組化試劑盒說明書操作:石蠟包埋組織，對(duì)石蠟塊進(jìn)行4 μm 連續(xù)切片，切片置于37℃烤箱2 h，之后經(jīng)二甲苯脫蠟和酒精梯度水化，再進(jìn)行熱抗原修復(fù)，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，10%山羊血清室溫封閉，將1 ∶75比例稀釋的兔抗人 SphK1 多克隆抗體(HPA022829，Sigma，USA)加于切片。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化和稀氨水反藍(lán)。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)棕色或棕黃色顆粒為SphK1 陽性反應(yīng)，其表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分:＜10%=0 分;10%～30%=1分;30%～50%=2 分;＞50%=3 分，評(píng)分≥1 分則認(rèn)為SphK1 蛋白陽性表達(dá)［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)檢測(cè)SphK1 蛋白表達(dá)及其與BIDC臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BIDC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織中SphK1 蛋白的表達(dá) 應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)SphK1 在58 例BIDC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中表達(dá)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)棕色或棕黃色顆粒為SphK1 陽性反應(yīng)，其表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核(圖1)。通過免疫組化評(píng)分分為SphK1陽性表達(dá)組(評(píng)分≥1)和SphK1陰性表達(dá)組(評(píng)分=0)，SphK1 蛋白在BIDC 組織中的陽性率為69.0%(40/58)，在對(duì)應(yīng)癌旁組織中的陽性率為17.2% (10/58)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.636，P=0.000)。

表1 SphK1 蛋白表達(dá)與BIDC 臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(n=58)Tab.1 Correlation between clinicopathological characteristics and protein expression of SphK1 in BIDC patients (n=58)

圖1 SphK1 蛋白在BIDC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的免疫組化染色(SP，×400，標(biāo)尺:100 μm)Fig.1 Immunohistochemical staining of SphK1 in BIDC and normal tumor-adjacent tissues (SP，×400，Scale bar:100 μm)

2.2 SphK1 蛋白表達(dá)與BIDC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SphK1 蛋白表達(dá)與BIDC 不同臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析詳見表1。結(jié)果顯示SphK1 蛋白在BIDC 組織中的陽性表達(dá)與ER 陰性(χ2=4.392，P=0.036)、PR 陰性(χ2=7.920，P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.033，P=0.025)和高腫瘤分期(χ2=7.117，P=0.008)有關(guān)。

3 討論

S1P 是一個(gè)有效的脂質(zhì)介質(zhì)，調(diào)節(jié)一系列的細(xì)胞進(jìn)程如細(xì)胞增殖、凋亡、鈣平衡、血管成熟和血管發(fā)生［8］。細(xì)胞中S1P 的含量較低，且通過緊密調(diào)節(jié)其合成與降解之間的平衡嚴(yán)格維持著S1P 低表達(dá)狀態(tài)，而SphK1 在調(diào)控這一平衡中發(fā)揮決定性的作用［9］。重要的是，抑制SphK1 基因表達(dá)能夠阻止激動(dòng)劑誘導(dǎo)的S1P 產(chǎn)生及其下游效應(yīng)，另外酶活性也證實(shí)SphK1 在S1P 效應(yīng)中發(fā)揮重要作用［10］。許多研究證實(shí)SphK1 在促進(jìn)腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，另外其在很多抗腫瘤治療中作為治療靶點(diǎn)［11］。SphK1 表達(dá)升高已經(jīng)在多種類型的腫瘤被證實(shí)，SphK1 mRNA 表達(dá)水平在多種腫瘤組織中的表達(dá)水平大約是正常組織中的2 倍，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、子宮癌腎癌和直腸癌［12］。人乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌組織免疫組化染色分析提示腫瘤細(xì)胞是SphK1 表達(dá)的主要來源，這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)SphK1 水平從而增加S1P 表達(dá)，進(jìn)而利用S1P 的生長(zhǎng)加速特性促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［13］。本研究通過免疫組化染色檢測(cè)SphK1 在BIDC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SphK1 蛋白在BIDC 組織中的陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。French 等［14］檢測(cè)了SphK1 mRNA 在一系列實(shí)體腫瘤及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SphK1 mRNA 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。另外，Ruckh?berle 等［15］檢測(cè)了43 種蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SphK1 蛋白在ER 陰性的乳腺癌組織中顯著高表達(dá)。提示本研究結(jié)果與之前報(bào)道的SphK1 mRNA 和蛋白在乳腺癌和正常組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致。

在各種腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型中抗腫瘤治療如化學(xué)療法和放射治療能夠下調(diào)SphK1 活性，提示SphK1在抗腫瘤治療中充當(dāng)感應(yīng)器角色，因此其高表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)SphK1 及其產(chǎn)物S1P調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)的誘導(dǎo)，而COX-2 是一個(gè)公認(rèn)的結(jié)腸癌發(fā)生促進(jìn)因子［16］。SphK1 活性下調(diào)增加前列腺癌細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)抗腫瘤治療的敏感性，另外上調(diào)SphK1 能夠?qū)苟喾N化療和電離輻射治療［17］。國(guó)外研究通過乳腺癌患者生存分析發(fā)現(xiàn)SphK1 高表達(dá)患者的預(yù)后更差，提示其是一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后標(biāo)志物［14］。本研究通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SphK1 蛋白表達(dá)與BIDC 不同臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ER 陰性、PR 陰性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高臨床分期的BIDC 組織中SphK1 陽性表達(dá)率顯著升高，提示SphK1 高表達(dá)與乳腺癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)。綜上所述，SphK1 在BIDC 組織中異常高表達(dá)并與惡性臨床病理特征密切相關(guān)，提示SphK1 是一個(gè)潛在的BIDC 患者預(yù)后分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為進(jìn)一步探索其功能提供了前期基礎(chǔ)。

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