歐陽(yáng)琦，楊青青，周曉櫻，林 戈，盧光琇，胡維新

(中南大學(xué) a．生命科學(xué)學(xué)院;b．生殖與干細(xì)胞研究所，湖南 長(zhǎng)沙410078)

小鼠胚胎干細(xì)胞依據(jù)其來源的發(fā)育階段以及細(xì)胞的生物學(xué)特性可分為兩類:一類是傳統(tǒng)意義上的胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)，來源于植入前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，處于原始多能性狀態(tài)(naive)［1］;一類是上胚層干細(xì)胞(mouse epiblast stem cells，mEpiSCs)，來源于植入后胚胎的上胚層，處于始發(fā)態(tài)的多能性狀態(tài)(Primed)［2］。這兩類小鼠多能性干細(xì)胞從克隆形態(tài)、分化能力、維持自我更新的信號(hào)通路、表觀遺傳學(xué)特征以及單細(xì)胞生長(zhǎng)能力等方面都存在明顯不同。mESCs克隆形態(tài)緊密，呈鳥巢狀隆起，三維生長(zhǎng);依賴LIF/stat3信號(hào)通路的活化來維持不分化狀態(tài);雌性mESCs具有兩條活化的X染色體;能夠耐受酶消化進(jìn)行單細(xì)胞傳代，有利于基因定點(diǎn)改造和篩選。而mEpiSCs培養(yǎng)時(shí)克隆形態(tài)扁平，二維生長(zhǎng);其不分化狀態(tài)的維持依賴bFGF和Activin A/Nodal信號(hào)通路;雌性mEpiSCs通常失活一條X染色體;單細(xì)胞傳代效率低，難以進(jìn)行基因定點(diǎn)改造操作。此外，mESCs具有更為完整的多能性，將mESCs注射到宿主囊胚腔內(nèi)能夠整合并參與后者的發(fā)育過程，形成嵌合體小鼠，并能分化為生殖細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)生殖系的傳遞。而mEpiSCs只具備部分多能性，雖然能夠向三個(gè)胚層的細(xì)胞分化，但不具有形成嵌合胚胎的能力，也基本無法實(shí)現(xiàn)生殖系的傳遞。以往常規(guī)“bFGF+Activin A”培養(yǎng)體系下分離的人胚胎干細(xì)胞(human ESCs，hESCs)在生物學(xué)特性上更接近于mEpiSCs，即處于始發(fā)態(tài)多能性［3，4］。因此，單細(xì)胞傳代效率低以及嵌合能力低等特性將在一定程度上限制了hESCs在基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用。

從2007年開始，人們嘗試各種方法建立naive的hESCs。Hanna等［5］過表達(dá)多能性基因?qū)F(xiàn)有的hESCs逆轉(zhuǎn)至原始多能性狀態(tài)，但是細(xì)胞不穩(wěn)定，撤除外源性基因的表達(dá)，細(xì)胞將失去原始態(tài)的表型，回復(fù)到始發(fā)態(tài)。Beucker課題組［6］利用在LIF條件下過表達(dá)5個(gè)重編程基因獲得了原始態(tài)的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，但是這類干細(xì)胞不能啟動(dòng)內(nèi)源性多能性關(guān)鍵基因的表達(dá)，分化能力受損。轉(zhuǎn)入外源性基因的方法只能獲得亞穩(wěn)態(tài)的原始多能性干細(xì)胞，且具有安全性隱患，因此建立一種無需轉(zhuǎn)基因操作、僅通過改變培養(yǎng)條件獲得原始態(tài)hESCs的方法是亟待解決的重要問題。目前國(guó)外有研究組利用不同的化學(xué)小分子和生長(zhǎng)因子組合實(shí)現(xiàn)了hESCs多能性的轉(zhuǎn)化，這些化學(xué)小分子組合通過激活或者抑制發(fā)育過程中不同的關(guān)鍵信號(hào)通路，使逆轉(zhuǎn)后的hESCs具有部分原始態(tài)多能性特征，但是逆轉(zhuǎn)后的hESCs之間存在明顯的基因表達(dá)差異［7-10］。而建立原始態(tài)hESCs的研究在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用已經(jīng)建立的hESCs資源，綜合并改良文獻(xiàn)報(bào)道的原始多能性干細(xì)胞培養(yǎng)條件，利用化學(xué)小分子對(duì)已建系的hESCs進(jìn)行多能性轉(zhuǎn)化，并評(píng)估了轉(zhuǎn)化后hESCs的原始多能性特征。

1 材料與方法

1．1 試劑

1．1．1 人胚胎干細(xì)胞系 chHES-278為本實(shí)驗(yàn)室自主建系，核型為46，XX;已進(jìn)行相應(yīng)干細(xì)胞特征性鑒定，符合NIH對(duì)胚胎干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1．1．2 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)從CF1小鼠第12．5天胚胎中分離獲得，經(jīng)絲裂霉素有絲分裂滅活后，作為hESCs的飼養(yǎng)層細(xì)胞。

1．1．3 培養(yǎng)基及配制 始發(fā)態(tài)hESCs培養(yǎng)基(DFES):基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12，15%血清替代物，0．1 mmol/Lβ-ME，2 mmol/L L-Glu，4 ng/mL bFGF，1%非必需氨基酸。

擬胚體(EB)培養(yǎng)基:即始發(fā)態(tài)hESCs培養(yǎng)基不添加bFGF。

2i(ERK1/2抑制劑及GSK3β抑制劑)培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12和Neurobasal，1%N2，2%B27，0．1 mmol/Lβ-ME，2 mmol/L L-Glu，3μmol/L CHIR99021(GSK3βi，Stemgent公 司)，1μmol/L PD0325901(ERK1/2i，Tocris公司)，1 000 U/L LIF(Millipore公司)。

原始態(tài)hESCs培養(yǎng)基(NHSM):基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12，2 g/L AlbuMAX，1%N2，1%非必需氨基酸，0．1 mmol/Lβ-ME，1 mmol/L L-Glu，12．5 mg/mL insulin(sigma公司)，8 ng/mL bFGF，1 ng/mL TGF-β1(Peprotech公 司)，3μmol/L CHIR99021(GSK3βi，Stemgent公司)，0．5μmol/L PD0325901(ERK1/2i，Tocris公司)，10μmol/L SP600125(JNKi，Tocris公司)，5μmol/L SB202190(p38i，Axon Medchem公司)，5μmol/L Go6983(PKCi，Tocris公司)，5μmol/L Y-27632(ROCKi，Millipore公 司)，1 000 U/L LIF(Millipore公司)。

1．2 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層細(xì)胞，分別采用hESCs培養(yǎng)基、2i培養(yǎng)基和NHSM培養(yǎng)基。機(jī)械或者酶消化傳代，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，每5-7天傳代一次。

1．3 hESCs的相關(guān)檢測(cè)

1．3．1 堿性磷酸酶(AKP)的檢測(cè) 采用Zymed Laboratories Inc公司提供的試劑盒對(duì)未分化的hESCs克隆進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行，陽(yáng)性染色結(jié)果為紫色。周邊的MEF不著色，為陰性對(duì)照。

1．3．2 細(xì)胞特異抗原的檢測(cè) 多能性干細(xì)胞特異性抗原，包括:TRA-1-60、TRA-1-81、OCT-4;三胚層特異性標(biāo)記，包括:AFP(內(nèi)胚層)、β-tubulin(外胚層)、SMA(中胚層);其他抗體:H3K27me3、E-cadherin。均采用間接免疫熒光法來檢測(cè)，步驟如下:4%的多聚甲醛固定20 min;0．1%Triton-X-100透膜10 min(針對(duì)核內(nèi)抗原，胞膜抗原不需要透膜);正常驢血清室溫封閉30 min;一抗4℃孵育過夜;加入Alexa Flour 488-連接二抗，室溫避光孵育1 h;DAPI復(fù)染核;熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)結(jié)果并照相。

1．3．3 多能性相關(guān)基因的檢測(cè) 收集未分化的hESCs，用Trizol抽提總RNA，用Roche公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR分析，以檢測(cè)其中多能性相關(guān)基因的表達(dá)，28S為反應(yīng)體系陽(yáng)性對(duì)照。Realtime PCR反應(yīng)條件:95℃5 min;45個(gè)循環(huán)(95℃10 s，58℃10 s，72℃15 s)。

1．3．4 單克隆形成率實(shí)驗(yàn) 未分化的hESCs經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞后計(jì)數(shù)，按照200個(gè)細(xì)胞/10 cm培養(yǎng)皿的密度種植，根據(jù)消化前hESCs的培養(yǎng)條件分別采用原始態(tài)或者始發(fā)態(tài)hESCs培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，6天后計(jì)數(shù)克隆數(shù)目，克隆數(shù)目與接種細(xì)胞數(shù)目之比即為單克隆形成率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 hESCs無法在2i體系下長(zhǎng)期培養(yǎng)

mESCs既可以在LIF+2i體系下成功分離建系，也可以長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)。但是將已建立的具有始發(fā)態(tài)多能性特征的hESCs轉(zhuǎn)至2i體系不能保持未分化狀態(tài)，難以傳代培養(yǎng)，往往3代之內(nèi)即完全分化，AKP染色呈陰性(圖1)。

2．2 2i聯(lián)合JNKi、P38i可以獲得類mESCs的原始態(tài)hESCs

在2i體系中進(jìn)一步添加JNK抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB202190)并聯(lián)合生長(zhǎng)因子bFGF、TGFβ，可以獲得形態(tài)上類似mESCs的hESCs，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為緊密、圓形、隆起的克隆。培養(yǎng)過程中，hESCs克隆周邊始終有少量分化細(xì)胞，將ERKi(PD0325901)的濃度從1μmol/L降低至0．5μmol/L，則細(xì)胞基本無分化。(圖2)

2．3 轉(zhuǎn)化后的hESCs具有naive多能性特征

將NHSM培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的hESCs進(jìn)行多能性特征性鑒定，結(jié)果提示轉(zhuǎn)化后的hESCs具有原始多能性的特征。始發(fā)態(tài)培養(yǎng)體系的hESCs進(jìn)行H3K27me3染色，細(xì)胞內(nèi)有凝集點(diǎn)，說明一條X染色體失活，轉(zhuǎn)移至naive體系下培養(yǎng)，H3K27me3凝集點(diǎn)消失，說明X染色體重新活化，再將轉(zhuǎn)化后的hESCs形成EB自發(fā)分化后，H3K27me3凝集點(diǎn)再次出現(xiàn)，說明X染色體又重新啟動(dòng)失活。將兩種體系下的hESCs進(jìn)行Xist基因表達(dá)的對(duì)比分析，結(jié)果也提示后者的Xist表達(dá)水平明顯偏低，與H3K27me3染色結(jié)果吻合。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)主要參與基因組從頭甲基化，在哺乳動(dòng)物的基因印記和X染色體失活的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，與始發(fā)態(tài)培養(yǎng)體系相比，naive培養(yǎng)體系下hESCs的DNMT3A和DNMT3B表達(dá)水平明顯升高。此外，轉(zhuǎn)化后的hESCs單克隆形成率明顯增高。始發(fā)態(tài)hESCs單克隆形成率約3%，添加具有抗凋亡作用的ROCKi，單克隆形成率提高到19%;轉(zhuǎn)化的hESCs單克隆形成率為38%，添加ROCKi后，單克隆形成率上升到75．6%，明顯高于始發(fā)態(tài)hESCs。(圖3)

圖1 2i體系和bFGF體系下hESCs培養(yǎng)的形態(tài)變化及AKP染色情況Fig．1 The morphologic change and AKP staining of hESCs cultured in the culture system containing 2i or bFGF

圖2 原始態(tài)hESCs培養(yǎng)體系中不同ERKi濃度培養(yǎng)下的hESCs形態(tài)圖Fig．2 The morphologic change of hESCs cultured in the naive ESCs culture system containing ERKi with different concentration．

2．4 轉(zhuǎn)化后的hESCs不具備mESCs多能性基因表達(dá)模式

將NHSM體系轉(zhuǎn)化后的hESCs與轉(zhuǎn)化前的hESCs進(jìn)行多能性基因的表達(dá)對(duì)比分析，除LIMCH1和TBX3以外，mEpiSCs中明確高表達(dá)的多能性基因OTX2以及mESCs高表達(dá)的多能性相關(guān)基因KLF4、PRDM14、REX1等在兩者之間均無明顯差別，ESRRB、FGF5、FOXA2不表達(dá)(圖4)。

3 討論

小鼠上胚層干細(xì)胞(mEpiSCs)的成功分離使人們意識(shí)到胚胎干細(xì)胞由于組織來源不同而具有不同的多能性狀態(tài)，早期原始多能性階段主要指植入前囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，以mESCs為代表，晚期始發(fā)態(tài)多能性階段主要指植入后胚胎的上胚層，以mEpiSCs和既往bFGF體系下培養(yǎng)的hESCs為代表。這兩類多能性干細(xì)胞在生物學(xué)特性上存在明顯不同，因此在應(yīng)用前景上也有明顯差別。mESCs具有更廣泛的發(fā)育潛能，能夠整合到宿主胚胎參與各器官組織的發(fā)育，形成嵌合體，因此可以用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者在宿主體內(nèi)形成完全由供者細(xì)胞來源的器官，能夠生殖系傳遞，在未來器官組織工程方面具有很大的發(fā)展前景。mEpiSCs和hESCs的發(fā)育潛能被進(jìn)一步限定，雖然能夠向三個(gè)胚層各種組織細(xì)胞分化，但是不能整合到宿主胚胎形成嵌合體，且不具備生殖系傳遞的能力，因此在器官組織工程方面用途受限。而轉(zhuǎn)基因往往需要進(jìn)行克隆篩選，mESCs能夠耐受單細(xì)胞傳代，是目前研究基因功能最常用的的哺乳動(dòng)物，而mEpiSCs和hESCs在胰酶處理后單克隆形成能力很差，很大程度上限制了hESCs的基因操作。

圖3 NHSM培養(yǎng)條件下的hESCs表達(dá)原始態(tài)多能性的生物學(xué)特性Fig．3 naive Characteristics of transformed hESCs cultured in NHSM media

圖4 轉(zhuǎn)化后原始態(tài)與始發(fā)態(tài)hESCs多能性基因表達(dá)的對(duì)比分析Fig．4 The expression analysis of pluripotency-related gene between naive and primed hESCs

意識(shí)到胚胎源性干細(xì)胞具有兩種不同的多能性狀態(tài)，人們開始尋找建立naive狀態(tài)hESCs的方法。2008年以前，mESCs依賴LIF+BMP4體系來維持自我更新，2008年，Ying創(chuàng)建了2i體系，ERK1/2i能夠抑制mESCs自身分泌的FGF4，而GSK3βi能夠活化Wnt信號(hào)通路，均可以加強(qiáng)mESCs的自我更新能力，能夠更好地維持原始多能性狀態(tài)［11］。許多在LIF+BMP體系下難以建系的物種都能夠通過2i體系建立原始多能性干細(xì)胞［12-15］。本研究將始發(fā)態(tài)的hESCs轉(zhuǎn)入2i體系中培養(yǎng)，細(xì)胞很快分化，說明2i不足以抗衡人類原始多能性狀態(tài)維持所需要克服的內(nèi)因障礙。Hanna等借助外源性基因(例如:Oct4、Klf2、Klf4)的導(dǎo)入，幫助hESCs在2i體系中獲得原始多能性，但是這種逆轉(zhuǎn)不穩(wěn)定，撤除外源性基因的表達(dá)，細(xì)胞將迅速回復(fù)到始發(fā)態(tài)多能性水平［5］。Buecker等過表達(dá)5個(gè)重編程因子雖然能夠獲得原始多能性的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hiPSCs)，但這類細(xì)胞以犧牲多能性為代價(jià)，細(xì)胞的分化能力受損［6］。上述研究證明轉(zhuǎn)入外源性基因的方法只能獲得亞穩(wěn)態(tài)的原始多能性干細(xì)胞，且具有安全性隱患。如果能夠不依賴基因操作，僅通過改變培養(yǎng)條件就實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞系多能性狀態(tài)的轉(zhuǎn)化，則有益于推動(dòng)這類干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。2013年12月，Gafni［7］和Chan［8］兩個(gè)課題組分別報(bào)道利用培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)了hESCs的多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)化，其培養(yǎng)體系能將現(xiàn)有的多能性干細(xì)胞從primed狀態(tài)逆轉(zhuǎn)到naive狀態(tài)。2014年3月，Ware等利用2i+bFGF也獲得了具有原始多能性特征的hESCs，但是該方法并且依賴bFGF，撤除bFGF后細(xì)胞培養(yǎng)過程中始終存在背景分化［10］。這些研究組所采用的naive hESCs培養(yǎng)條件不盡相同，通過分析利用這些不同培養(yǎng)體系獲得的“naive”多能性干細(xì)胞的基因表達(dá)譜，結(jié)果提示它們之間基因表達(dá)存在明顯差異，并且部分mESCs高表達(dá)的原始多能性相關(guān)基因在轉(zhuǎn)化后的hESCs中無明顯差別。我們參考并改良了naive hESCs培養(yǎng)體系，也獲得了具有原始多能性特征的hESCs，細(xì)胞重新獲得兩條活化的X染色體，單克隆形成率明顯增高，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性增高等。但與mESCs比較，多能性基因表達(dá)模式也不盡相同，因此這些具有naive特征的hESCs是否為真正意義上的原始多能性干細(xì)胞還有待考證，而上述培養(yǎng)條件中哪些是naive多能性維持的關(guān)鍵因素、它們發(fā)揮作用的分子機(jī)制以及不同培養(yǎng)體系造成的基因表達(dá)差別是否影響其生物學(xué)功能和安全性等問題還需要進(jìn)一步研究。

目前的研究結(jié)果表明人類原始態(tài)和始發(fā)態(tài)這兩種多能性狀態(tài)維持的分子機(jī)制存在差異，與已知小鼠相應(yīng)多能性狀態(tài)維持的分子機(jī)制也不盡相同。如果能更好地認(rèn)識(shí)上述問題，不僅可以幫助我們了解人類早期胚胎發(fā)育規(guī)律、多能性狀態(tài)建立的過程和分子機(jī)制，還能夠幫助我們建立原始多能性的hESCs，拓展hESCs在再生醫(yī)學(xué)以及遺傳性疾病機(jī)理研究上的應(yīng)用。

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