侯曉青，劉丹，王易

上海中醫(yī)藥大學免疫學與病原生物學教研室，上海 201203

恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis，M.smegmatis)近年來較多應(yīng)用于分枝桿菌感染及相關(guān)的免疫學研究中，是一種相對理想的實驗?zāi)Ｐ?，這主要基于其生物學特性和良好的實驗安全性。此外，在圍繞其免疫生物學特點而引申展開的其他有關(guān)感染與免疫研究中，也有一些新的發(fā)現(xiàn)。

1 恥垢分枝桿菌的主要生物學特性

恥垢分枝桿菌由Lustgarten于1884年從梅毒患者的硬下疳和梅毒瘤中分離獲得。1年后，Alvarez和Tavel在健康人生殖器分泌物中也發(fā)現(xiàn)了與Lustgarten描述相似的微生物，恥垢分枝桿菌據(jù)此得名。恥垢分枝桿菌是一種抗酸分枝桿菌[1]。與放線菌門分枝桿菌屬的其他分枝桿菌比較，恥垢分枝桿菌有以下特性。

1.1 快速生長與非致病性

恥垢分枝桿菌的生長速度是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)的10倍[2]。分枝桿菌的生長速率可能取決于其核糖體的操縱子。通常分枝桿菌屬具有2種核糖體RNA操縱子rrnA和rrnB[3]，rrnA為所有分枝桿菌共有，依菌種的不同可含有2～5個啟動子。只有1個啟動子的rrnB僅存在于生長快速的分枝桿菌中[4]，如恥垢分枝桿菌。恥垢分枝桿菌在大多數(shù)實驗室合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d即可形成可見菌落。對于正常個體，恥垢分枝桿菌基本可視作非致病菌[5]。恥垢分枝桿菌的非致病性與其基因的穩(wěn)定性相關(guān)，mutM和mutY是2個主要核苷酸修復(fù)酶(與修復(fù)DNA氧化性損傷有關(guān))的編碼基因。研究mutY缺陷恥垢分枝桿菌時發(fā)現(xiàn)，mutY基因具有穩(wěn)定恥垢分枝桿菌非致病性的功能[6]。

1.2 基因與結(jié)構(gòu)特性

恥垢分枝桿菌的基因組測序已完成，與結(jié)核分枝桿菌共享超過2 000個同源染色體，具有與結(jié)核分枝桿菌及其他分枝桿菌相同的獨特細胞壁結(jié)構(gòu)。這些特性使恥垢分枝桿菌成為研究結(jié)核分枝桿菌和其他致病性分枝桿菌的實驗?zāi)Ｐ?。通過對恥垢分枝桿菌mc2155菌株的細胞表面蛋白分析，可了解恥垢分枝桿菌生長特性；同時，對復(fù)合脂質(zhì)代謝和細菌環(huán)境相互作用機制的研究，為抗分枝桿菌藥物的研發(fā)提供了一條新的途徑[7]。恥垢分枝桿菌具有分枝桿菌普遍存在的通道形成蛋白——孔蛋白，此結(jié)構(gòu)可影響其對殺菌劑的易感性[8]。研究證實，恥垢分枝桿菌攝取硝酸鹽和硫酸鹽均依賴于孔蛋白[9]。恥垢分枝桿菌生物膜的形成依賴環(huán)境中多磷酸鹽的含量[10]，其抗酸染色特性與酸性壓力下參與類胡蘿卜素生物合成的蛋白有關(guān)[11]。

1.3 免疫應(yīng)答特性

恥垢分枝桿菌通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶/腫瘤壞死因子(cysteinyl aspartate specific proteinase/tumor necrosis factor，caspase/TNF)依賴途徑誘導宿主細胞凋亡。相對于特殊致病分枝桿菌來說(如結(jié)核分枝桿菌)，非致病菌可誘導機體產(chǎn)生更強的天然免疫應(yīng)答。經(jīng)檢測恥垢分枝桿菌感染后宿主細胞的荷菌數(shù)及白細胞介素12(interleukin 12，IL-12)和TNF的分泌水平后證實，天然免疫應(yīng)答可能是非致病性快速生長分枝桿菌被殺傷的主要原因[12]。

2 恥垢分枝桿菌在抗結(jié)核分枝桿菌研究中的應(yīng)用

作為研究結(jié)核分枝桿菌的替代模型，恥垢分枝桿菌較多應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的基因與結(jié)構(gòu)分析、耐藥性和疫苗研究。

2.1 恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌功能蛋白及基因研究

恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌一樣，可以休眠狀態(tài)適應(yīng)微氧環(huán)境，但其休眠機制尚未完全明確。前期大量實驗證實，低氧和低碳這2個壓力因素可誘導宿主體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌休眠。在此基礎(chǔ)上，Cordone等[13]對參與休眠活動的基因進行了鑒定并描述了這些基因的特征。該實驗分別研究了不能在低氧和低碳環(huán)境中存活的2種恥垢分枝桿菌突變株，發(fā)現(xiàn)均為uvrA基因發(fā)生突變，只是轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)域不同，但并不影響其表型。插入結(jié)核分枝桿菌uvrA基因后，恥垢分枝桿菌uvrA突變株的功能得到修復(fù)，證實uvrA缺失使其不能在低氧和低碳環(huán)境中存活；同時表明結(jié)核分枝桿菌與恥垢分枝桿菌的uvrA基因具有一定同源性。

rv0901是結(jié)核分枝桿菌的一種蛋白編碼基因，其功能尚不明確。為探索其特征，Zhang等[14]從結(jié)核分枝桿菌標準毒株H37Rv的基因組中擴增該基因，進行蛋白表達并純化。通過構(gòu)建含rv0901的重組質(zhì)粒，并將其電轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌中，誘導受體菌表達目的蛋白Rv0901，經(jīng)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)電泳鑒定該蛋白；通過測定細胞或動物的存活率、凋亡率、一氧化氮(nitric oxide, NO)和干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)分泌量，研究重組恥垢分枝桿菌基因或蛋白功能。結(jié)果證實，rv0901與結(jié)核分枝桿菌的毒力和免疫原性有關(guān)。

結(jié)核分枝桿菌編碼基因rv3402c在被感染的人和小鼠巨噬細胞中均上調(diào)。實驗構(gòu)建表達rv3402c基因的恥垢分枝桿菌，證實其編碼蛋白能增加胞內(nèi)重組菌存活，存活率的提高與其對TNF-α、IL-1β等前炎癥因子所致?lián)p害的抵抗性相關(guān)，也與形成前炎癥因子的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路——核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、p38等相關(guān)[15]。

2.2 恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌耐藥性研究

張文利等[16]將恥垢分枝桿菌用于研究影響結(jié)核分枝桿菌的生存因素，以及研發(fā)抗結(jié)核化合物、治療耐藥結(jié)核分枝桿菌感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌的生存和繁殖依賴其細胞壁結(jié)構(gòu)的完整和準確，其細胞壁的特殊結(jié)構(gòu)成分具有聚阿拉伯糖。細胞壁結(jié)構(gòu)及其合成因素，可直接影響細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。在分枝桿菌中，Emb蛋白家族(EmbA、EmbB、EmbC)參與聚阿拉伯糖的生物合成。構(gòu)建EmbB的N端跨膜區(qū)與EmbC的C端結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的雜化質(zhì)粒表達載體 pVV16-BN722-CC36，同時構(gòu)建表達載體pVV16-BN722，它們能在恥垢分枝桿菌中表達，經(jīng)測序鑒定表達正確后分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的恥垢分枝桿菌(embC基因敲除菌株△embC、embB基因敲除菌株△embB和野生型恥垢分枝桿菌)以研究基因的功能。用蛋白免疫印跡法測定相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)EmbC蛋白的C端結(jié)構(gòu)域具有催化功能，但在發(fā)揮作用時需N端結(jié)構(gòu)域使其能定位在某一特定位置，否則不能正確催化脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)中聚阿拉伯糖的合成。關(guān)于EmbB蛋白，其N端完整的跨膜區(qū)除能使EmbB蛋白定位于特定位置外，還具有一定的催化活性。該研究表明，對于Emb家族成員，能在細胞膜上正確定位是其發(fā)揮作用的前提；同時，雖然Emb家族成員間的同源性非常高，但定位作用不能相互補充與替代。

多重耐藥和廣泛耐藥結(jié)核病的傳播是棘手的公共健康問題。已發(fā)現(xiàn)苯并噻嗪酮(benzothiazinone，BTZ)和二硝基苯甲酰胺(dinitrobenzamide，DNB)具有較高的抗結(jié)核分枝桿菌(包括廣泛耐藥菌株)的活性。BTZ的靶點是DprE1蛋白，已有研究證實DNB與BTZ可依賴相同通路抑制耐藥菌株生長，表明DNB可能與BTZ有同樣的作用靶點。在恥垢分枝桿菌中，硝基還原酶NfnB過表達可使硝基向氨基轉(zhuǎn)化大量減少，導致BTZ失活。分離天然耐DNB的恥垢分枝桿菌突變株，其中16株DprE1的Cys394發(fā)生突變的菌株對DNB高度抵抗，熒光滴定和質(zhì)譜分析表明這跟DprE1與DNB連接有關(guān)。對DNB抵抗水平低的恥垢分枝桿菌突變株含有多種編碼NfnB反轉(zhuǎn)錄抑制劑的突變。液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法分析表明，NfnB也是DNB失活的原因。以上研究表明，恥垢分枝桿菌中DNB與BTZ藥物具有共同抗菌機制[17]。

2.3 恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌噬菌體研究

噬菌體能侵入并裂解宿主細胞，在胞內(nèi)菌所致感染性疾病中具有很好的應(yīng)用價值?？股貜V泛應(yīng)用后其應(yīng)用價值被忽視，而耐藥菌株的出現(xiàn)使人們再次對其進行評價。劉平等[18]利用恥垢分枝桿菌對用分枝桿菌噬菌體Legendre治療耐藥結(jié)核病的潛力進行了研究，通過制備Legendre噬菌斑，純化噬菌體后得知其屬長尾噬菌體科；提取其基因組，確定核酸類型為雙鏈DNA噬菌體；Legendre抗原性低，宿主譜廣，對恥垢分枝桿菌極度易感，能裂解恥垢分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌標準株及多數(shù)臨床耐藥株，具有抗耐藥結(jié)核病的潛力。然而，在噬菌體的實際應(yīng)用中，還存在許多未知因素。如Chen等[19]研究證實，糖肽脂生物合成的缺乏導致了恥垢分枝桿菌對噬菌體I3的抵抗，這可能是結(jié)核分枝桿菌逃脫噬菌體殺滅的機制。

2.4 恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌疫苗研究

目前可應(yīng)用的結(jié)核分枝桿菌疫苗只有卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)，且不能取得滿意的保護率，故尋求效率更高的疫苗以降低結(jié)核病的全球傳播成為迫切需求。在新型結(jié)核分枝桿菌疫苗研究中，使用帶有結(jié)核分枝桿菌保護性表位的重組恥垢分枝桿菌成為經(jīng)典方法。

肝素結(jié)合血凝素(heparin-binding haemagglutinin，HBHA)是分枝桿菌細胞表面介導細菌黏附于上皮細胞的蛋白，與結(jié)核分枝桿菌的播散有關(guān)，故被認為是一種可激活細胞免疫的候選免疫原。但研究發(fā)現(xiàn)，只有甲基化的HBHA才能有效激發(fā)淋巴細胞分泌大量IFN-γ，發(fā)揮類似BCG的保護性免疫作用。有研究構(gòu)建了HBHA與人IL-2(human IL-2，hIL-2)融合的重組恥垢分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的HBHA可表現(xiàn)為具有免疫原性的甲基化形式。該重組菌株在小鼠體內(nèi)可誘導保護性免疫應(yīng)答，促進IFN-γ和IL-2分泌，且減少肺內(nèi)荷菌量，效果類似于BCG[20]。

esx-3是分枝桿菌進化中的一個保守基因，參與分枝桿菌對天然免疫殺滅的逃逸。帶有完整esx-3基因的恥垢分枝桿菌經(jīng)靜脈大劑量接種，可使小鼠迅速致病；而esx-3缺陷株感染的小鼠，則可經(jīng)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴的免疫應(yīng)答清除細菌。向該突變株中引入結(jié)核分枝桿菌esx-3基因后，小鼠具有一定的免疫力，雖較esx-3缺陷株明顯減弱，但仍可對強毒性結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生殺傷作用。該研究表明，重組菌株產(chǎn)生較多的保護性免疫依賴的記憶性CD4+T細胞，還有適應(yīng)性免疫應(yīng)答細胞因子參與。該研究揭示了esx-3基因的毒力作用，表明esx-3缺陷重組株是潛在的有效的結(jié)核分枝桿菌備選疫苗[21]。

6 kDa早期分泌性抗原靶分子(early secretory antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)是從結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中分離得到的一種早期分泌蛋白。esat-6基因僅存在于結(jié)核分枝桿菌等致病性分枝桿菌中。ESAT-6蛋白可誘導T細胞增殖活化和細胞因子分泌，與結(jié)核分枝桿菌免疫原性相關(guān)，提示其可成為結(jié)核分枝桿菌疫苗的候選基因。李巖等[22]用穿梭載體將結(jié)核分枝桿菌esat-6基因轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌，確定其能在恥垢分枝桿菌中表達，且導入后不影響恥垢分枝桿菌的生長，也不增加重組菌對巨噬細胞的毒性。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是在某些刺激物(如細菌脂多糖、TNF和IFN-γ等)誘導下才表達的巨噬細胞的一種活化標記。通過檢測巨噬細胞iNOS表達水平、裂解巨噬細胞計數(shù)胞內(nèi)存活細菌數(shù)，證實重組菌能誘導巨噬細胞活化表達iNOS，并增強巨噬細胞的殺傷活性，且重組菌在胞內(nèi)存活數(shù)顯著低于對照組。

徐苗等[23]對恥垢分枝桿菌疫苗抗結(jié)核分枝桿菌感染的作用機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)活化巨噬細胞中產(chǎn)生的NO在抗微生物感染中具有重要作用，可有效抑制或殺滅結(jié)核分枝桿菌，且NO生成量與其抑制能力呈正相關(guān)。該研究選用恥垢分枝桿菌疫苗對免疫動物NO產(chǎn)生水平的影響來探討其抗結(jié)核分枝桿菌感染的機制，結(jié)果顯示，不同劑量疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的NO水平均顯著高于對照組，提示該疫苗可促進小鼠巨噬細胞產(chǎn)生NO，并對免疫功能進行調(diào)節(jié)。

2.5 恥垢分枝桿菌與結(jié)核病治療及其機制研究

自噬是包括分枝桿菌在內(nèi)的病原菌入侵細胞后引起的胞內(nèi)應(yīng)答，能被哺乳動物西多莫司(雷帕霉素)靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的直接抑制劑誘導，然后殺滅感染細胞中的分枝桿菌。但Zullo等[24]研究顯示，分枝桿菌感染的巨噬細胞在誘導自噬的同時也激活mTOR；選用恥垢分枝桿菌再次實驗后發(fā)現(xiàn)，低濃度mTOR抑制劑可有效減少或阻斷mTOR活性，以應(yīng)對分枝桿菌感染，殺滅恥垢分枝桿菌所需抑制劑濃度更高。而在自噬相關(guān)基因和蛋白缺陷來源的巨噬細胞中，高濃度抑制劑也可抑制恥垢分枝桿菌生長，提示高濃度下非自噬機制可能參與了殺菌過程，進一步表明由mTOR抑制劑誘導的自噬是一種人為增強殺滅分枝桿菌的方法，但還有更多自噬相關(guān)的內(nèi)源性生化過程有待揭示。

3 恥垢分枝桿菌在非結(jié)核分枝桿菌感染與免疫研究中的應(yīng)用

除作為研究結(jié)核分枝桿菌感染的模型外，恥垢分枝桿菌也用于其他抗感染研究和超敏反應(yīng)性疾病研究。

3.1 重組恥垢分枝桿菌與幽門螺桿菌定植及抗幽門螺桿菌研究

2009年，徐永柱等構(gòu)建了攜帶幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)ureB基因質(zhì)粒(pLUB)的重組恥垢分枝桿菌疫苗，用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記該重組菌，構(gòu)建感染模型。結(jié)果顯示，小鼠胃、脾中均檢測到GFP表達，其他組織及對照組未檢測到綠色熒光；其他指標與對照組無差異。由此確定重組恥垢分枝桿菌可在胃和脾組織中分布，且對小鼠無系統(tǒng)毒性作用[25]。幽門螺桿菌感染是一種黏膜感染，黏膜免疫可對感染小鼠產(chǎn)生保護作用。Lü等[26]構(gòu)建表達幽門螺桿菌外膜蛋白26(outer membrane protein 26 kDa，Omp26)抗原的重組恥垢分枝桿菌黏膜免疫疫苗，與野生恥垢分枝桿菌株對照，重組疫苗免疫的小鼠60%未感染幽門螺桿菌；與對照組相比，慢性胃炎的組織病理改變也較輕微；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)結(jié)果提示，重組恥垢分枝桿菌免疫后胃和脾中IL-2和IFN-γ表達增加。結(jié)果表明，該重組疫苗具有抗幽門螺桿菌感染的預(yù)防性保護作用，也表明抗原誘導的免疫應(yīng)答可抑制幽門螺桿菌定植。

機體自然感染幽門螺桿菌后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不能清除細菌，持續(xù)感染反導致胃黏膜免疫病理損害。有效的疫苗/制劑接種可誘導機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答，但機制尚不明確。向廷秀等[27]用恥垢分枝桿菌初步探討預(yù)防幽門螺桿菌感染的作用機制，在用重組恥垢分枝桿菌免疫小鼠后進行幽門螺桿菌攻擊。結(jié)果顯示，免疫后重組恥垢分枝桿菌制劑可誘導幽門螺桿菌特異性IgG、IgA水平升高，以IgG2a占優(yōu)勢。用幽門螺桿菌抗原刺激后，各免疫組小鼠脾淋巴細胞均明顯增殖，胃黏膜固有層IgA陽性標記腺體數(shù)明顯高于對照組。幽門螺桿菌攻擊前，各免疫組胃和脾組織中已出現(xiàn)Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12、IL-2表達，而無Th2型細胞因子IL-4、IL-6、IL-10表達，對照組和野生恥垢分枝桿菌組胃黏膜和脾組織中各細胞因子均無表達。幽門螺桿菌攻擊后，對照組和野生恥垢分枝桿菌組胃組織中出現(xiàn)以IFN-γ為主的細胞因子增多，且顯著高于重組恥垢分枝桿菌組；而重組恥垢分枝桿菌制劑組脾組織中則出現(xiàn)以IL-4為主的細胞因子增多，且顯著高于對照組。結(jié)果提示，含有幽門螺桿菌抗原的重組恥垢分枝桿菌通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡而產(chǎn)生作用。

3.2 恥垢分枝桿菌與哮喘黏膜免疫干預(yù)研究

郭盛等[28]用卵清蛋白(ovalbumin peptide，OVA)致敏氣道激發(fā)建立哮喘模型，實驗設(shè)哮喘組、恥垢分枝桿菌干預(yù)組和對照組。結(jié)果顯示，恥垢分枝桿菌干預(yù)可顯著增高哮喘小鼠肺組織防御素β2(defensin β2，Ddfb2)mRNA表達，降低哮喘小鼠表達增高的巨噬細胞炎性蛋白1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)mRNA；降低支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和淋巴結(jié)培養(yǎng)上清液中的MIP-1、MIP-2、IL-4，增加BALF中的IFN-γ；顯著降低血清總IgE、OVA-IgE、OVA-IgG1，增加OVA-IgG2a，降低OVA特異性IgG1/IgG2a比值。綜上結(jié)果表明，恥垢分枝桿菌黏膜免疫可干預(yù)哮喘發(fā)生，使恥垢分枝桿菌有望成為繼BCG之后通過調(diào)節(jié)IgG1/IgG2a比值而預(yù)防哮喘的另一候選菌株。

解婷等[29]給小鼠口服免疫不同親和力屋塵螨抗原Der p2重組恥垢分枝桿菌，末次免疫后第14、28、56天分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定小鼠血清和脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2及IL-4的含量，結(jié)果IFN-γ、IL-2逐漸升高，IL-4逐漸降低，8周時更明顯。這些改變在添加聯(lián)合空腸彎曲菌外膜蛋白的重組菌組比僅有屋塵螨抗原的重組菌組更明顯。體外Der p2刺激后，野生恥垢分枝桿菌組無明顯變化，另2組變化明顯。表明不同親和力Der p2重組恥垢分枝桿菌經(jīng)口服免疫均能誘導Th1型免疫應(yīng)答，且含Der p2的重組菌誘導產(chǎn)生的Th1型優(yōu)勢應(yīng)答具有Der p2抗原特異性，彌補了黏膜型疫苗低親和力的不足。

3.3 恥垢分枝桿菌與寄生蟲病防治研究

抗原蟲的免疫機制較復(fù)雜，增加了原蟲疫苗研究的復(fù)雜性，而以恥垢分枝桿菌為載體的原蟲抗原重組表達能使相應(yīng)問題簡化。

李俊華等[30]依據(jù)疫苗防治疾病的經(jīng)驗，擬研制廉價、安全、有效的弓形蟲疫苗。該課題組誘導弓形蟲RH株致密顆粒蛋白4(dense granule protein 4，gra4)基因在恥垢分枝桿菌中表達：用PCR從RH株DNA中擴增該基因，克隆構(gòu)建載體質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化gra4基因片段至恥垢分枝桿菌中。用該重組菌免疫小鼠，蛋白免疫印跡法檢測免疫小鼠血清中的弓形蟲抗體，以鑒定重組蛋白的抗原性。結(jié)果顯示，該重組菌能表達重組蛋白GRA4，具有刺激小鼠產(chǎn)生抗弓形蟲抗體的抗原性。

瘧疾是嚴重危害人類健康的感染性疾病。其中間日瘧長期被忽視，但其可反復(fù)發(fā)作并引起嚴重并發(fā)癥，因此有效的疫苗開發(fā)是控制和消滅間日瘧原蟲感染的有效途徑。間日瘧原蟲裂殖子主要蛋白1(pvMSP1)表達于瘧原蟲裂殖子表面，該跨膜糖蛋白MSP1-19片段位于胞外區(qū)，與間日瘧原蟲入侵人類紅細胞過程關(guān)系緊密。陳勇等[31]用PCR體外擴增pvMSP1-19，克隆構(gòu)建載體質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌中，熱誘導此重組恥垢分枝桿菌，SDS-聚丙 烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后觀察pvMSP1-19蛋白表達，蛋白免疫印跡法鑒定其免疫學活性。結(jié)果證實，構(gòu)建的重組恥垢分枝桿菌能表達具有免疫反應(yīng)的pvMSP1-19蛋白。

杜氏利什曼原蟲感染的發(fā)生與病原體誘導的Th1/Th2平衡偏離有關(guān)，疾病嚴重程度主要取決于IL-12和IL-10的產(chǎn)生。用恥垢分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖干預(yù)杜氏利什曼原蟲感染小鼠的巨噬細胞，觀察小鼠巨噬細胞中蛋白激酶信號級聯(lián)調(diào)節(jié)宿主效應(yīng)的應(yīng)答能力。結(jié)果表明，脂阿拉伯甘露糖通過影響杜氏利什曼原蟲感染的巨噬細胞的多種信號通路，誘導Th2極化所需的細胞因子表達[32]。

3.4 恥垢分枝桿菌與病毒感染性疾病疫苗研究

恥垢分枝桿菌亦用于研究病毒感染所致疾病機制的研究。

胡興斌等[33]探索了恥垢分枝桿菌運載乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相關(guān)抗原的可行性。結(jié)果顯示，重組恥垢分枝桿菌免疫組抗體效價峰值高于DNA疫苗免疫組，且維持時間更長；前者誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖刺激指數(shù)及特異性細胞毒性T細胞殺傷率均顯著高于DNA疫苗免疫組。結(jié)果證實，重組恥垢分枝桿菌可在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，與DNA基因疫苗相比，重組恥垢分枝桿菌活菌免疫策略具有一定優(yōu)勢。

Ahmed等[34]用恥垢分枝桿菌等細菌評估了機體共生菌對人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)感染的可能影響。結(jié)果顯示，革蘭陰性菌可通過激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)及其下游Ⅰ型干擾素信號通道而抑制HIV-1復(fù)制，而恥垢分枝桿菌等革蘭陽性菌無此作用。

4 結(jié)語

綜上所述，恥垢分枝桿菌因其非致病性特性，在抗結(jié)核分枝桿菌研究中發(fā)揮著獨有的作用，主要集中于通過轉(zhuǎn)基因方式對結(jié)核分枝桿菌相應(yīng)蛋白進行功能詮釋、耐藥基因及新型抗結(jié)核分枝桿菌疫苗的研究。尤其是恥垢分枝桿菌在新疫苗研究中的應(yīng)用，使人們對疫苗的界定產(chǎn)生了新的思考。同時，由于相應(yīng)的免疫學特性，其在非分枝桿菌感染和免疫性疾病的研究中也嶄露頭角。

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