鄔敏，張小楠，陳捷亮，袁正宏，

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心, 上海 201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032

由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性乙型肝炎是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的疾病[1,2]。α干擾素(interferon α，IFN-α)治療，特別是長(zhǎng)效干擾素——聚乙二醇化α干擾素(pegylated interferon α，PEG-IFNα)治療，由于能獲得較高的持久應(yīng)答率和較低的耐藥突變率，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但干擾素治療通常只能在有限的患者中獲得完全應(yīng)答[3,4]。目前認(rèn)為，宿主針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答是決定HBV感染后不同病情轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的最關(guān)鍵因素，而這種免疫應(yīng)答在宿主、病毒等因素影響下存在異質(zhì)性。目前已知與干擾素治療應(yīng)答相關(guān)的因素主要有：基線血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平、基線HBV DNA水平、性別及治療過(guò)程中HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)效價(jià)動(dòng)態(tài)等[5]。此外，病毒基因型對(duì)療效也有顯著影響，如HBV基因型C型患者的干擾素應(yīng)答率要低于B型患者[6]。然而，這些指標(biāo)預(yù)測(cè)的靈敏度與特異度遠(yuǎn)未令人滿(mǎn)意，因此繼續(xù)尋找潛在的與干擾素療效預(yù)測(cè)相關(guān)的分子標(biāo)記仍是一個(gè)十分有意義的工作。

近年來(lái)，宿主的表觀遺傳學(xué)因素在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。HBV感染的家族聚集性特點(diǎn)[7]、單卵雙生子感染HBV后表型不一致[8]等現(xiàn)象均凸現(xiàn)了表觀遺傳學(xué)因素在HBV感染中的作用。DNA甲基化是最常見(jiàn)的一種表觀遺傳學(xué)修飾方式，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)密切相關(guān)。已有研究顯示，廣泛的甲基化差異存在于HBV 感染的急、慢性各階段，DNA甲基化有可能參與針對(duì)HBV免疫應(yīng)答強(qiáng)度的調(diào)節(jié)[9]。然而，慢性乙型肝炎患者基因組DNA甲基化狀態(tài)與干擾素治療療效的關(guān)系鮮有研究。

甲基化DNA免疫共沉淀-芯片(methylated DNA immunoprecipitation-chip，MeDIP-chip)檢測(cè)是目前高通量分析基因組DNA甲基化的一種準(zhǔn)確、可靠技術(shù)，可檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)，研究啟動(dòng)子甲基化對(duì)基因的調(diào)控，比較不同樣本的甲基化圖譜及尋找診斷和預(yù)后的分子標(biāo)記。本研究從接受長(zhǎng)效干擾素治療的慢性乙型肝炎患者治療前血漿標(biāo)本中提取DNA樣本，用Roche-NimbleGen CpG Promoter芯片分析，尋找干擾素應(yīng)答組與無(wú)應(yīng)答組的差異甲基化基因和信號(hào)通路，探討干擾素治療應(yīng)答異質(zhì)性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

取接受長(zhǎng)效干擾素治療的慢性乙型肝炎患者治療前血漿標(biāo)本20份(上海市公共衛(wèi)生臨床中心標(biāo)本庫(kù))。其中男性14例、女性6例；中位年齡33歲。根據(jù)治療12周后HBV DNA下降水平是否≥2 log10，將患者分為快速應(yīng)答(rapid response，RR)或無(wú)應(yīng)答(nonresponse，NR)組，每組各10例?；颊叩幕厩闆r見(jiàn)表1。兩組患者的性別、年齡、HBV基因型、基線ALT與HBV DNA水平等臨床指標(biāo)基本均衡(P>0.05)。僅性別因素略有差異，但在分析兩組甲基化差異時(shí)已進(jìn)行校正。本研究通過(guò)上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會(huì)審批，遵從《赫爾辛基宣言》(1975年)。

患者入組條件為：①年齡18～60歲；②與HBV e 抗原(HBV e antigen，HBeAg)陽(yáng)性慢性乙型肝炎診斷﹝血清HBsAg、HBV DNA 和HBeAg 陽(yáng)性，HBV e 抗體(HBV e antibody，HBeAb)陰性，血清ALT升高﹞相符的臨床病史；③血清HBsAg陽(yáng)性持續(xù)超過(guò)6個(gè)月；④血清ALT水平升高(>1.0正常值上限，>1.0 ULN)；⑤血清HBV DNA水平>5×104拷貝/ml；⑥患者最近6個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)核苷類(lèi)似物、干擾素等抗病毒治療和免疫調(diào)節(jié)治療；⑦患者排除其他病毒﹝包括丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)﹞感染；⑧患者排除自身免疫性肝病﹝抗核抗體(antinuclear antibody，ANA) 陰性，抗線粒體抗體 (antimitochondrial antibody，AMA)陰性﹞。

表1入組病例基本臨床數(shù)據(jù)

Tab.1Baselineclinicalcharacteristicsofenrolledpatients

Clinical variableEntire cohortRR groupNR groupP valueNumber of patients201010Age (year) Median3332.533Range20-5420-5427-430.978 2GenderMale1459Female651ALT (×ULN)4.71±3.174.50±3.224.85±3.300.831 5HBV DNA (log10 copies/ml)7.26±0.696.72±0.827.62±0.100.239 7HBsAg (IU/ml)>250>250>250HBV genotypeB211C1899

ALT ULN=40 IU/L. Non-pariedttest.

1.2 全血DNA提取

使用血液基因組抽提試劑盒(DK60，上海萊楓生物科技有限公司)對(duì)20份血漿樣本進(jìn)行DNA提取。用Nanodrop測(cè)定DNA質(zhì)量，總量>5 μg且260/280 nm處光密度(optical density，OD)值在1.7～1.9為合格。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MeDIP-chip

由上海康成生物工程有限公司完成。主要步驟包括：超聲打斷基因組DNA、MeDIP、MeDIP與 Input DNA片段線性擴(kuò)增、熒光標(biāo)記、芯片雜交、圖像采集和數(shù)據(jù)分析等。采用羅氏公司NimbleGen DNA甲基化芯片(Human DNA Methylation 2.1M Deluxe Promoter v2 Array)進(jìn)行雜交。該芯片覆蓋27 867個(gè)CpG島、26 210個(gè)基因啟動(dòng)子(上游8 kb至下游3 kb)及730個(gè)微小RNA(microRNA,miRNA)啟動(dòng)子(上游20 kb至轉(zhuǎn)錄本末)。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用MEDME算法計(jì)算出快速應(yīng)答組與無(wú)應(yīng)答組之間的差異性甲基化區(qū)域(differentially methylated region，DMR)，并在基因組層面定位出DMR對(duì)應(yīng)的基因和miRNA啟動(dòng)子區(qū)或CpG島。用GenBank注釋基因，并將篩選出的差異甲基化基因分別上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)分類(lèi)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分類(lèi)。以上由上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿伞?/p>

1.5 MeDIP-定量聚合酶鏈反應(yīng)

MeDIP-定量聚合酶鏈反應(yīng)(MeDIP-quantitative polymerase chain reaction，MeDIP-qPCR)是通過(guò)定量PCR分別檢測(cè)啟動(dòng)子序列在樣本免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)DNA和Input DNA中的含量，根據(jù)其在兩者中的相對(duì)含量，即免疫共沉淀效率(IP efficiency)，來(lái)確定該啟動(dòng)子序列在樣本中的甲基化水平。免疫共沉淀效率計(jì)算公式如下：IP efficiency (%)=2-[Ct(IP)-Ct(Input)]× [Con(Input)/Con(IP)] ×100%。各樣本IP DNA和Input DNA由上海康成生物工程有限公司提供。在有多個(gè)連續(xù)且趨勢(shì)一致的甲基化差異探針的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)。qPCR在StepOnePlus熒光定量PCR儀(ABI公司)上進(jìn)行，體系采用Thunderbird SYBR qPCR Mix(ToYoBo QPS-201)，總反應(yīng)體積為25 μl，樣品經(jīng)95 ℃ 變性3 min后，按95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束前系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)熒光產(chǎn)物的量。所有循環(huán)結(jié)束后，繪制熔解曲線，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

MeDIP-qPCR每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各處理組間均數(shù)差異比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為有顯著性差異。用GraphPad Prism軟件完成上述統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，并作圖。

2 結(jié)果

2.1 MeDIP-chip結(jié)果

采用MEDME算法，根據(jù)每個(gè)樣本的信號(hào)值與Input信號(hào)值的比值計(jì)算每個(gè)探針部位的絕對(duì)甲基化水平(absolute methylation score，AMS)。比較快速應(yīng)答組與無(wú)應(yīng)答組的探針AMS值，P<0.05且平均AMS差值(AMS_dif，ABS)>8的探針為甲基化差異探針。進(jìn)一步篩選多個(gè)連續(xù)探針均有差異甲基化且趨勢(shì)相似的區(qū)域，即為DMR。

結(jié)果顯示，快速應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組中基因的甲基化模式顯著改變。定位于啟動(dòng)子區(qū)的DMR分析顯示，與快速應(yīng)答組相比，無(wú)應(yīng)答組中有261個(gè)DMR呈高甲基化，涉及291個(gè)基因和9個(gè)miRNA，其中116個(gè)為功能未知基因；327個(gè)DMR呈低甲基化，涉及307個(gè)基因和22個(gè)miRNA，其中131個(gè)為功能未知基因。而定位于CpG島的DMR分析顯示，與快速應(yīng)答組相比，無(wú)應(yīng)答組中DMR大多呈高甲基化，且位于啟動(dòng)子區(qū)(表2)。

表2差異性甲基化區(qū)域統(tǒng)計(jì)

Tab.2MEDMEanalysisofDMRinNRgroupcomparedtoRRgroupa

HypermethylationHypomethylationPromoter regions261Gene291 (116b)miRNA9327Gene307 (131b)miRNA22CpG islands289Promoter248Intra-/intergenic413Promoter0Intra-/intergenic3

Note:aNon pairedttest;bGenes with unknown function.

使用GO和KEGG研究甲基化差異基因的功能分類(lèi)和所屬的信號(hào)通路。結(jié)果顯示，這些基因所涉及的細(xì)胞功能主要為細(xì)胞生物進(jìn)程及其調(diào)節(jié)、細(xì)胞損傷和修復(fù)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和信號(hào)通路等。同時(shí)，這些甲基化狀態(tài)發(fā)生改變的基因涉及多個(gè)信號(hào)通路，主要集中在鈣離子信號(hào)通路、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路、肝臟代謝相關(guān)通路等(表3)。

2.2 MeDIP-qPCR驗(yàn)證

本研究通過(guò)MeDIP-qPCR驗(yàn)證了甲基化芯片結(jié)果的可靠性。隨機(jī)選擇35個(gè)基因的啟動(dòng)子，qPCR分別檢測(cè)各基因啟動(dòng)子序列在每個(gè)樣本IP DNA和Input DNA中的含量，計(jì)算免疫共沉淀效率。免疫共沉淀效率越高，表明該啟動(dòng)子序列在樣本中的甲基化水平越高。qPCR結(jié)果顯示，31個(gè)啟動(dòng)子的引物擴(kuò)增良好，熔解曲線為單峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增。免疫共沉淀效率的計(jì)算結(jié)果顯示，31個(gè)啟動(dòng)子中有25個(gè)在快速應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組中甲基化水平高低變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果相符，與芯片結(jié)果的一致率超過(guò)80%，提示甲基化芯片的檢測(cè)結(jié)果可信度較高。部分基因啟動(dòng)子的MeDIP-qPCR結(jié)果如圖1所示。

表3差異甲基化基因的生物學(xué)通路分析

Tab.3DifferentiallymethylatedgenesenrichedinKEGGpathway

KEGG pathway Gene numberGene symbolaEnrichmentP valuebPurine metabolism14ADCY3↓,PAICS↑,PDE4C↑,PDE9A↓,PPAT↑3.389 44.08E-04Maturity onset diabetes of the young5FOXA2↑,HNF1B↑,NKX6-1↑,ONECUT1↑, PKLR↓3.107 97.80E-04Gap junction9GUCY1B3↓,MAPK7↑,PDGFRA↑,PLCB3↓, SRC↑,TUBB1↓2.825 41.49E-03Neurotrophin signaling pathway10ABL1↑,ATF4↓,CALM1↑,MAPK11↑,MAPK7↑, NTF3↓,NTF4↓,PSEN1↓2.307 94.92E-03Long-term potentiation6ADCY3↓,ATF4↓,CALM1↑,PLCB3↓1.728 31.87E-02Fructose and mannose metabolism4FBP2↓,GMPPB↓,PFKFB3↓,PMM2↓1.648 52.25E-02Synthesis and degradation of ketone bodies2OXCT1↑,OXCT2↓1.545 02.85E-02Phosphatidylinositol signaling system6CALM1↑,INPP5E↑,PI4KA↓,PLCB3↓1.521 63.01E-02Cell cycle8ABL1↑,CCND1↑,CCND3↓,GADD45B↑,LAT↓, MCM7↓,MYC↑,TFDP1↓1.401 73.97E-03Calcium signaling pathway10ADCY3↓,CALM1↑,CHRM1↑,P2RX3↓, PDGFRA↑,PLCB3↓,TRPC1↑1.380 94.16E-02

Note：a↑indicates hypermethylated in NR group， ↓indicates hypomethylated in NR group;bFisher’s exact test.

圖1MeDIP-qPCR驗(yàn)證基因的甲基化水平

Fig.1MeDIP-qPCR

3 討論

干擾素，特別是長(zhǎng)效干擾素治療慢性乙型肝炎，能顯著提高患者的血清轉(zhuǎn)化率和病毒核酸清除率，且不易引發(fā)耐藥突變，但存在效應(yīng)率較低(30%～40%)的缺陷[3,4]。因此，目前急需一套能針對(duì)患者實(shí)際情況預(yù)測(cè)其療效的系統(tǒng)，從而讓最有可能治療成功的患者接受干擾素治療，而讓可能性較低的患者接受核苷類(lèi)似物治療。預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎患者干擾素療效不是一個(gè)簡(jiǎn)單的任務(wù)，目前研究主要集中于分析臨床參數(shù)與預(yù)后的關(guān)系。但數(shù)據(jù)顯示，這些參數(shù)的預(yù)測(cè)能力有限[5]。

不同個(gè)體在HBV感染的易感性、疾病進(jìn)程和治療應(yīng)答方面有很大差異，這其中涉及宿主、病毒、環(huán)境等因素的共同作用，遠(yuǎn)未明確。但大多數(shù)研究表明，宿主的免疫應(yīng)答在HBV易感性和感染后轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[10]。相應(yīng)地，抗HBV感染免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制就尤為重要。近10年來(lái)，表觀遺傳學(xué)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。在HBV感染中，表觀遺傳學(xué)因素也發(fā)揮了重要作用。特別是母嬰傳播形成的單卵雙生子HBV 感染中遺傳背景相似而疾病表型不一致的現(xiàn)象[8]，更加提示表觀遺傳學(xué)差異的影響。近年來(lái)，甲基化芯片技術(shù)的誕生使研究全基因組的甲基化譜成為可能。由于芯片具有高通量的特點(diǎn)，其結(jié)果能在全局上評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答的狀態(tài)。

目前，商業(yè)化的甲基化芯片在HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)和其他相關(guān)肝病研究中已廣泛應(yīng)用，但利用此技術(shù)尋找與慢性乙型肝炎干擾素療效相關(guān)分子標(biāo)記的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究從表觀遺傳學(xué)角度出發(fā)，采用MeDIP-chip技術(shù)檢測(cè)了從10例干擾素快速應(yīng)答和10例無(wú)應(yīng)答慢性乙型肝炎患者血漿中提取的DNA樣本，嘗試尋找與干擾素療效相關(guān)的甲基化修飾異常，以期為進(jìn)一步了解慢性乙型肝炎患者干擾素應(yīng)答異質(zhì)性機(jī)制做一次有意義的探索。

已有研究顯示，HBV感染本身即可導(dǎo)致宿主基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，這與HBV上調(diào)宿主DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的表達(dá)有關(guān)[11,12]。在HBV感染的急性期和慢性期均存在廣泛的DNA甲基化差異[9]。處于慢性HBV感染不同階段的患者，即免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期和再激活期，可能均存在不同的基因甲基化譜；同樣，患者是否接受治療，或是否有其他病毒共感染，也可能影響其基因的甲基化狀態(tài)。為避免上述因素對(duì)結(jié)果造成偏倚，本研究對(duì)入組病例進(jìn)行了嚴(yán)格篩選。本研究中入組的病例，其臨床診斷均屬于HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎，快速應(yīng)答組與無(wú)應(yīng)答組的HBsAg和DNA水平較一致，保證兩組間病例的免疫狀態(tài)和體內(nèi)病毒復(fù)制狀態(tài)一致，盡可能避免HBV感染狀態(tài)不同造成的組間差異。

本研究篩選出大量的差異甲基化基因，并進(jìn)一步通過(guò)MeDIP- qPCR證實(shí)了芯片結(jié)果的可靠性。但還需采用亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序(bisulfite sequencing PCR，BSP)等獨(dú)立實(shí)驗(yàn)對(duì)所得的差異甲基化基因水平進(jìn)行精確定量分析，并需在大樣本隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究的生物功能分析結(jié)果顯示，這些差異基因涉及多個(gè)信號(hào)通路，主要集中在鈣離子信號(hào)通路、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路、肝臟代謝相關(guān)通路等，而這些通路均與干擾素功能或HBV生活周期的調(diào)控有關(guān)。已有研究表明，在巨噬細(xì)胞中，鈣離子依賴(lài)性激酶可增強(qiáng)Ⅰ型干擾素的JAK-STAT信號(hào)通路[13]；而在肝細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)鈣通道及鈣離子信號(hào)則直接參與HBV的復(fù)制過(guò)程[14-16]。膽汁分泌與肝臟代謝是體內(nèi)干擾素重要的消除途徑；HBV基因表達(dá)更是與肝代謝過(guò)程緊密相連，如葡萄糖和脂肪的產(chǎn)生和利用、膽汁酸的產(chǎn)生和分泌[17-20]。對(duì)這些信號(hào)通路所涉及的差異基因進(jìn)一步分析和驗(yàn)證，了解受甲基化調(diào)控的基因所具有的分子生物學(xué)功能，將有利于從分子機(jī)制角度揭示干擾素應(yīng)答異質(zhì)性的原因，并有可能發(fā)現(xiàn)潛在的預(yù)測(cè)干擾素療效的血液分子標(biāo)記。

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