李蒙，孫桂芹，陳菁，李天勝，王蕾，策力木格，陳力

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

腦膜炎敗血伊麗莎白金菌(Elizabethkingiameningoseptica，EM)是非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，可廣泛分布于土壤和水環(huán)境中[1]。該菌又名腦膜膿毒金黃桿菌(Flavobacteriummeningosepticum, FM；Chryseobacteriummeningosepticum, CM)，2005年后基于16S rRNA序列分析后被歸于伊麗莎白金菌屬[2]。EM為條件致病菌，可引起新生兒腦炎和敗血癥[3,4]。植入性醫(yī)療器械或其他污染因素[5]使其院內(nèi)獲得性感染病例增多，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit, ICU)中。據(jù)報(bào)道，中國臺灣地區(qū)EM感染的發(fā)病率從1999年的7.5/10萬入院病例上升至2006年的35.6/10萬入院病例[6]；2006～2007年中國非發(fā)酵革蘭陰性桿菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)結(jié)果顯示，EM臨床分離株占非發(fā)酵革蘭陰性桿菌臨床分離株的1.02%[7]。EM對醫(yī)院常用的頭孢類、碳青霉烯類、氨基糖苷類抗生素呈現(xiàn)天然耐多藥[8]，感染后2周內(nèi)病死率高達(dá)25%以上[6,9]。迄今對EM的研究多集中在臨床病例報(bào)道和耐藥性研究，關(guān)于其快速檢測方法和特征性分子機(jī)制的研究較少。

N-糖苷酶(peptide:N-glycanase, PNGase)是去糖基化酶的一種，專一識別N-糖蛋白或N-糖肽中的Asn-X-Ser/Thr序列，將Asn上連接的糖鏈從底部完整切除[10]。PNGase最早于1977年從杏仁中發(fā)現(xiàn)，并命名為PNGase A，隨后發(fā)現(xiàn)其在酵母、線蟲、擬南芥、魚、小鼠、人等真核生物中廣泛存在，參與生長、發(fā)育及降解錯誤折疊的糖蛋白等過程[11-14]。但在原核生物中PNGase極為罕見，僅在EM中發(fā)現(xiàn)了此類酶，并命名為PNGase F[15]。PNGase F是糖生物學(xué)研究中最常用的工具酶，對研究細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、糖鏈對糖蛋白功能的影響和糖鏈結(jié)構(gòu)的分析具有重要意義[16-19]，但PNGase F在EM中的生物學(xué)功能仍未知。

本實(shí)驗(yàn)室前期對臨床分離的一株EM菌株FMS-007進(jìn)行全基因組測序(GenBank序列號：CP006576)分析并驗(yàn)證功能，發(fā)現(xiàn)該菌株中可能同時存在2種PNGase，即PNGase F和PNGase F-Ⅱ。FMS-007菌株中的PNGase F-Ⅱ與PNGase F在核苷酸水平和氨基酸水平的同源性不高，分別為46.9%和21.8%，但蛋白結(jié)構(gòu)與PNGase F相似，并具有與PNGase F相同的切除糖肽和糖蛋白上N-連接寡糖鏈的功能(已投稿)。PNGase F和PNGase F-Ⅱ這2個同工酶同時存在預(yù)示PNGase可能在EM的生活史中具有重要生理功能。本研究利用核酸檢測技術(shù)，分析了PNGase F和PNGase F-Ⅱ在浙江省3家三級甲等醫(yī)院65株EM臨床分離株中的分布情況，為建立特異聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測方法和研究其生物學(xué)意義奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株2010年7月～2012年12月于浙江省紹興市人民醫(yī)院、臺州市中心醫(yī)院和寧波市李惠利醫(yī)院收集EM臨床分離株。無菌操作采集患者血液、下呼吸道分泌物、尿液及創(chuàng)口分泌物等標(biāo)本，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，分離獲得純培養(yǎng)。剔除同一患者多次檢出的重復(fù)菌株，共收集EM菌株65株，其中紹興市12株、臺州市7株、寧波市46株。所有菌株經(jīng)法國生物梅里埃公司VITEK-2自動微生物鑒定分析系統(tǒng)鑒定為EM。

1.1.2儀器和試劑細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeSTAR?Max DNA Polymerase和DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；C1000 Touch梯度PCR儀和Sub-Cell GT水平電泳槽為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；FluorChem E凝膠成像系統(tǒng)為美國Protein Simple公司產(chǎn)品。

1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成本實(shí)驗(yàn)室已完成一株來自浙江省紹興市人民醫(yī)院的EM臨床分離株FMS-007的全基因組測序(GenBank序列號：CP006576)，根據(jù)FMS-007全基因組序列中PNGaseF基因和PNGaseF-Ⅱ基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。FMS-007的PNGaseF基因與ATCC 13253的同源性為77%，故針對ATCC 13253中的PNGaseF基因設(shè)計(jì)了第2對引物。16SrRNA引物為細(xì)菌檢測通用引物[20]。 所有引物 (表1) 送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1PCR引物序列

Tab.1PCRprimers

PrimerSequenceSize (bp)16S rRNA F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1 500 R5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'PNGase FA F5'-GATATTGTATACGGGACACCGG-3'326 R5'-CTCTGATTATTGATAGGGTTTGCTG-3'B F5'-TGCTTTTCCATAAGGGACACC-3405 R5'-ACATTTACGCTTCCGGCTGAT-3'PNGase F-Ⅱ F5'-TGCAGCCTTATTACAGGTGCTC-3'528 R5'-CCCATTAAATAAAGACTGATCGTCC-3'

1.2 方法

1.2.1NCBI中EM菌株P(guān)NGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因查找從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載ElizabethkingiameningosepticumATCC 13253 (GCA_000401415.1)、ElizabethkingiameningosepticumNBRC 12535 (GCA_000367325.1)、Elizabethkingiameningosepticum502 (GCA_000447375.1)基因組序列文件，以FMS-007的全基因組序列作為模板，利用基本局部相似性比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)進(jìn)行序列比對。然后，應(yīng)用Sanger Center開發(fā)的ACT工具[21]進(jìn)行基因組比對?；诨蚪M比對的位置對應(yīng)關(guān)系，根據(jù)FMS-007基因組PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ位置定位另外3株菌株基因組中的PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因，并在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線BLAST驗(yàn)證。

1.2.2DNA提取應(yīng)用天根生化科技(北京)有限公司細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取EM基因組DNA，-20 ℃保存。抽提方法為DNA柱吸附洗脫法，按試劑盒說明書操作。

1.2.3PCR檢測臨床菌株P(guān)CR反應(yīng)體系為50 μl，包括模板DNA(約50 ng/μl)1 μl、上游引物(10 μmol/L)2 μl、下游引物(10 μmol/L)2 μl、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase(2×) 25 μl，用無菌去離子水補(bǔ)至50 μl。上述PCR反應(yīng)引物包括16SrRNA基因、PNGaseF基因和PNGaseF-Ⅱ基因的引物。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 5 s，循環(huán)35次。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性對照(SX7菌株和ATCC 13253菌株)和陰性對照(H2O、陰溝腸桿菌和鮑曼不動桿菌臨床分離株)。于PCR完成后，各取4 μl 16SrRNA基因、PNGaseF基因和PNGaseF-Ⅱ基因PCR產(chǎn)物混合，用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓設(shè)定為120 V，電泳時間為1 h，并在凝膠成像系統(tǒng)中將結(jié)果拍照留存。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST工具進(jìn)行序列比對。16S rRNA比對結(jié)果用于菌株類別的確認(rèn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，配對計(jì)數(shù)資料比較采用配對χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCBI中EM菌株P(guān)NGase基因的分布

除本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的FMS-007全基因組核酸序列外，在NCBI中檢索到3株已發(fā)表全基因組核酸序列的EM，分別是EM (ATCC 13253)、EM (NBRC 12535)和EM (502)。根據(jù)FMS-007全基因組核酸序列中PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ的位置查找另3株菌株中是否也存在PNGase基因時發(fā)現(xiàn)，這4株菌株均攜帶PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ(表2)。其中FMS-007與502的PNGaseF核酸序列高度同源(100%)；ATCC 13253與NBRC 12535的PNGaseF核酸序列高度同源(100%)；FMS-007與ATCC 13253的PNGaseF核酸序列同源性為77%， 故將 FMS-007 和 ATCC 13253 菌株攜帶的PNGaseF分別命名為PNGaseF(A) 和PNGaseF(B)。以上4株EM菌株的PNGaseF-Ⅱ核酸序列同源性較好(81.8%～100%)。因此，檢測EM臨床分離株中PNGase基因時，分別針對PNGaseF(A) 和PNGaseF(B) 基因設(shè)計(jì)2對不同引物，利用PNGaseF-Ⅱ保守區(qū)設(shè)計(jì)1對引物(表1)。

表2NCBI中EM菌株P(guān)NGaseF和PNGaseF-Ⅱ的攜帶情況

Tab.2DistributionofPNGaseFandPNGaseF-ⅡamongEMsinNCBI

StrainGenBank assembly IDPNGase FABPNGase F-ⅡElizabethkingia meningosepticum FMS-007CP006576+-+Elizabethkingia meningosepticum ATCC 13253GCA_000401415.1-++Elizabethkingia meningosepticum NBRC 12535GCA_000367325.1-++Elizabethkingia meningosepticum 502GCA_000447375.1+-+

2.2 EM臨床分離株中PNGase基因的分布情況

于浙江省采集EM臨床分離株65株，應(yīng)用組合PCR檢測16SrRNA、PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因。全部菌株16SrRNA基因擴(kuò)增陽性(圖1)，經(jīng)測序并與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列對比，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與引物設(shè)計(jì)一致，且均是EM特異性的16SrRNA。

M, marker DL2000; 1, FMS-007; 2, ATCC 13253; 3-7, EM specimens; 8, H2O; 9,Enterobactercloacaespecimen.

圖116SrRNA、PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ的PCR產(chǎn)物電泳

Fig.1ElectrophoresisofPCRproductsof16SrRNA(1500bp),andfragmentsofPNGaseF(326bpor405bp)andPNGaseF-Ⅱ (528bp)genes

65株EM臨床分離株中，PNGaseF擴(kuò)增陽性41株，其中PNGaseF(A) 基因片段擴(kuò)增陽性33株、PNGaseF(B) 基因片段擴(kuò)增陽性8株；PNGaseF-Ⅱ擴(kuò)增陽性62株(表3)。PNGase基因陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序并與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列對比，產(chǎn)物大小與設(shè)計(jì)大小一致，且均是PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ特異性的。PNGase陽性菌64株，陽性率為98.5%；PNGaseF/PNGaseF-Ⅱ共陽性菌39株，共陽性率為60.0%；PNGaseF(A) 陽性菌33株，陽性率為50.8%；PNGaseF(B) 陽性菌8株，陽性率為12.3%；PNGaseF-Ⅱ陽性菌62株，陽性率為95.4%；PNGaseF-Ⅱ陽性率高于PNGaseF(配對χ2檢驗(yàn)，P<0.01)(表4)。

表365株EM菌株中PNGase亞型分布

Tab.3DistributionofPNGaseamong65clinicalEMstrains

Subtype of PNGasePositive case (rate)Negative case (rate)PNGase F A33 (50.8%)24 (36.9%)B8 (12.3%)PNGase F-Ⅱ62 (95.4%)3 (4.6%)PNGase F/PNGase F-Ⅱ39 (60.0%)26 (40.0%)

表465株EM菌株中PNGaseF與PNGaseF-Ⅱ陽性率的比較

Tab.4ComparisonofPNGaseFandPNGaseF-Ⅱin65clinicalEMstrains

PNGase F-Ⅱ positivePNGase F-Ⅱ negativeTotalPNGase F positive39(60.0%)2(3.1%)41(63.1%)PNGase F negative23(35.4%)1(1.5%)24(36.9%)Total62(95.4%)3(4.6%)65(100%)

3 討論

EM作為條件致病菌，其所致感染多為散發(fā)報(bào)道，未引起臨床重視。但近年隨著植入性醫(yī)療器械的廣泛使用，EM感染在ICU中的發(fā)病率逐年升高；且因其具有天然耐多藥的特性，給臨床治療帶來困難[22]。因此，建立該菌快速檢測方法有利于指導(dǎo)臨床用藥，對其特征性酶的分析有利于進(jìn)一步深入研究。

EM具有非發(fā)酵，無動力，氧化酶、觸媒、吲哚陽性等生化特征[23]，現(xiàn)有臨床手段是根據(jù)以上生化特征來鑒定，但這種方法費(fèi)時費(fèi)力，不利于及時指導(dǎo)臨床用藥，因此有必要建立核酸檢測方法。PNGase在真核生物中廣泛存在，但在原核生物中PNGase F僅報(bào)道存在于EM中[15]，因此PNGase F可作為EM的特異性分子標(biāo)記用于檢測。本研究檢測65株EM臨床分離株，發(fā)現(xiàn)PNGase基因的攜帶率高達(dá)98.5%，提示將其作為EM檢測的特異分子標(biāo)記靈敏度高。其中，PNGaseF-Ⅱ的攜帶率(95.4%)高于PNGaseF(63.1%)，提示PNGaseF-Ⅱ作為分子標(biāo)記檢測EM的靈敏度高于PNGaseF，更適用于EM的核酸檢測。根據(jù)現(xiàn)有公開的4株EM全基因組核酸序列比對PNGaseF基因，發(fā)現(xiàn)存在PNGaseF(A)和PNGaseF(B)，其序列同源性低于PNGaseF-Ⅱ，因此本研究設(shè)計(jì)的針對PNGaseF基因的引物可能只適用于PNGaseF(A)和PNGaseF(B)，不適用于其他未知亞型的PNGaseF，從而導(dǎo)致假陰性的存在。

根據(jù)PNGase對EM進(jìn)行分型未見報(bào)道。本研究首次根據(jù)PNGase F和PNGase F-Ⅱ這2種同工酶將其分為4型：PNGase F和PNGase F-Ⅱ共陽性、PNGase F陽性但PNGase F-Ⅱ陰性、PNGase F陰性但PNGase F-Ⅱ陽性及PNGase F和PNGase F-Ⅱ共陰性。本研究顯示，經(jīng)16S rRNA確認(rèn)過的65株EM中，以PNGase F和PNGase F-Ⅱ共陽性菌株為主，占60.0%；其次是PNGase F陰性但PNGase F-Ⅱ陽性亞型，占35.4%；其余2種亞型所占比例較低：PNGase F陽性但PNGase F-Ⅱ陰性菌株占3.1%，PNGase F和PNGase F-Ⅱ共陰性菌株占1.5%。不同亞型PNGase在EM中的生物學(xué)意義未知，但同時攜帶PNGase F和PNGase F-Ⅱ的菌株占60.0%，提示EM中這2個同工酶的存在非常重要，可能在細(xì)菌感染、代謝或抵抗外環(huán)境中起作用，值得深入研究。

本研究的不足之處在于對PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因進(jìn)行PCR檢測時僅以小樣本(10株)陰溝腸桿菌和鮑曼不動桿菌(數(shù)據(jù)未顯示)作為陰性對照，初步判斷其特異性，還需以金黃桿菌屬內(nèi)的產(chǎn)吲哚金黃桿菌、吲哚金黃桿菌、黏金黃桿菌、金礦金黃桿菌和大菱鲆金黃桿菌作為陰性對照，并對檢測方法的特異度進(jìn)行評價(jià)。其中產(chǎn)吲哚金黃桿菌的陰性對照最重要，因其臨床分離菌株數(shù)占金黃桿菌屬的42.9%[7]，與EM臨床分離菌持平。本研究中的EM臨床菌株全部來自浙江省，而不同地區(qū)來源的EM臨床菌株中PNGase特征可能不同，這有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究建立了EM中PNGase檢測和分型的方法，發(fā)現(xiàn)PNGase在EM中攜帶率高達(dá)98.5%，可作為分子標(biāo)記用于EM檢測。同時，EM以PNGase F和PNGase F-Ⅱ共陽性亞型為主，提示2個同工酶的存在可能具有重要的生物學(xué)意義，值得進(jìn)一步研究。

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