張振清，張爽，黃弋，張波，胡曉敏，袁志明

1. 中國科學院武漢病毒研究所農業(yè)與環(huán)境微生物重點實驗室，武漢 430071； 2. 中國科學院大學，北京 100039； 3. 湖北大學，武漢 430062

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)是一種有包膜的負鏈RNA病毒，形態(tài)多樣，包括桿狀、絲狀及“L”形。埃博拉病毒屬絲狀病毒科，有蘇丹埃博拉病毒(Sudan Ebola virus，SUDV)、扎伊爾埃博拉病毒(Zaire Ebola virus，ZEBOV)、塔伊森林埃博拉病毒(Ta? Forest Ebola virus, TAFV)(也稱科特迪瓦埃博拉病毒，Cote d’Ivoire Ebola virus)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo Ebola virus，BDBV)和雷斯頓埃博拉病毒(Reston Ebola virus，RESTV)5種亞型。EBOV 一般通過血液、體液和分泌液等傳播，能引發(fā)靈長類動物出血熱癥狀，人感染后病死率高達90%以上，目前還沒有有效預防和治療的藥物和疫苗，被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)列為對人類危害最嚴重的生物安全四級病毒和潛在的生物戰(zhàn)劑。該病毒首次于1976年在非洲報道，此后幾十年一直在非洲大地零星暴發(fā)感染[1-3]。2014年3月以來，EBOV感染在幾內亞、利比里亞、塞拉利昂、尼日利亞西非4國暴發(fā)和流行。根據(jù)WHO發(fā)布的疫情最新通報，截至8月20日，西非地區(qū)累計出現(xiàn)確診、疑似和可能EBOV感染病例2 615例，1 427例死亡，已成為國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，并對其他國家的公共健康構成威脅。盡管到目前為止，EBOV疫情主要發(fā)生在非洲，但隨著中國與非洲經(jīng)濟、文化聯(lián)系的日益密切，大量人員頻繁往來，該疫情將對中國的公共衛(wèi)生體系建設和疫情防控帶來嚴峻的挑戰(zhàn)和威脅。為此，國家有關部門對此次疫情給予了高度關注，發(fā)布了EBOV防控的指導性文件，啟動了相應的應急科技支撐項目開展EBOV預防和控制的研究。

EBOV的基因組為單股負鏈RNA，大小約19 kb，包裹在直徑800～900 nm的核衣殼中[4]，基因順序為3′-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-5′[5,6]。每種基因產物均由各自的mRNA所編碼。包膜糖蛋白(glycoprotein，GP)基因形成2個讀碼框架，分別編碼非結構分泌型糖蛋白(secretory glycoprotein，sGP)和全長跨膜GP。sGP作為早期產物大量生產和分泌，參與免疫逃避反應，然后通過RNA剪接機制合成全長GP。GP是病毒顆粒外表面突出的唯一結構蛋白，與細胞受體結合并介導病毒通過內吞作用進入宿主細胞。

GP作為EBOV的最主要結構蛋白，是最理想的誘導產生中和抗體的抗原。目前大多數(shù)有關EBOV抗體檢測技術、特異性抗病毒疫苗和藥物研究還停留在實驗室階段，難以用其活病毒和臨床患者血清驗證相關檢測技術的有效性，也難以開展臨床試驗以評估研發(fā)的疫苗和藥物。這些限制條件制約了EBOV檢測和治療技術的發(fā)展。為深入研究EBOV感染與致病機制，建立快速抗體檢測技術，探討蛋白結構與功能的關系，研制抗病毒血清和抗病毒藥物，進行GP表達和純化具有重要的現(xiàn)實意義。本研究利用獲得的全長EBOVGP基因，進行了原核和真核表達，制備了多克隆抗體(簡稱多抗)，為下一步檢測技術的建立和EBOV的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑、質粒、引物、菌株和細胞

Tris、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)購自Sigma公司，甘油購自國藥集團化學試劑有限公司，質粒提取試劑盒購自Omega公司，凝膠回收試劑盒購自Transgene公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗鼠多抗購自Promega公司，限制性內切酶購自TaKaRa公司和NEB公司。 ZEBOV GP(注：并非全長序列，全長序列只能在感染過程中通過RNA剪接形成，病毒基因組中只存在單一的剪接前GP基因)基因序列(NC_002549)由北京奧科生物技術有限公司合成。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)引物由上海英俊生物技術有限公司合成(表1)。質粒pET28a(+)、pGEX6p-1、pcDNA3.1(+)、pEGFP-N1和大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coil)JM109、HB101、BL21(DE3)、BL21(Rosseta)及BHK21細胞和HEK293T細胞由本實驗保存。

1.2 EBOV GP基因的點突變

為在大腸埃希菌和真核細胞中表達全長成熟GP，在GP基因的885位核苷酸(nucleotide，nt)后加入1個堿基A。以EBOVGP基因為模板，分別用引物Primer1F/Primer2R和Primer1R/Primer2F進行PCR擴增，獲得片段1和片段2。將獲得的2個片段等摩爾量混合作為模板，利用引物Primer1F/Primer1R進行Overlap PCR，獲得融合DNA片段，然后將其插入pMD18T-simple轉化E.coilJM109，涂布在含有100 μg/ml氨芐西林的LB固體平板，篩選陽性克隆，經(jīng)測序正確后命名為pMD18T-simple-edited GP。

表1所用引物

Tab.1Theprimersusedinthisstudy

引物序列(5'→3')功 能Primer1FGGAATTCATGGGGCGTTACAGGAATA擴增GP連入pET28aPrimer1RCCCAAGCTTCTAAAAGACAAATTTGCATATACAG擴增GP連入pET28aPrimer2FGAAACTAAAAAAAACCTCACTAGA點突變形成edited GPPrimer2RTCTAGTGAGGTTTTTTTTAGTTTC點突變形成edited GPPrimer3FCGGAATTCATCCCACTTGGAGTCATCCA擴增GP1(33^313 aa)連入pET28aPrimer3RCCCAAGCTTTTAGTTTGATACAACTGTGAAAGACAACT擴增GP1(33^313 aa)連入pET28aPrimer4FCGGAATTCAAGAAGGACTTCTTCAGCTCAC擴增GP1(190^313 aa)Primer4RCCCAAGCTTTTAGTTTGATACAACTGTGAAAGACAACT擴增GP1(190^313 aa)Primer5FCGGAATTCGAAGCAATTGTCAATGCTCAACC擴增GP2(502^632 aa)Primer5RCCCAAGCTTTTAATCAACAAAATCATGAATAATCTGATCAAT擴增GP2(502^632 aa)Primer6FCGCAAGCTTACCATGGGCGTTACAGGAATATTGC擴增edited GP連入pcDNA3.1(+)Primer6R-1CGGGTACCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCA- AAGAC擴增edited GP連入pcDNA3.1(+)Primer6R-2CTGAGATGAGTTTTTGTTCAAAGACAAATTTGCATATACAG- AATAAAGC擴增edited GP連入pcDNA3.1(+)Primer7FCGCAAGCTTACCATGGGCGTTACAGGAATATTGC擴增GP1連入pcDNA3.1(+)Primer7R-1CCGGTACCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTT擴增GP1連入pcDNA3.1(+)Primer7R-2CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTCTTCGAGTTC- TTCTCCC擴增GP1連入pcDNA3.1(+)Primer8FCCGAAGCTTACCATGGAAGCAATTGTCAATGCTCAACC擴增GP2連入pcDNA3.1(+)Primer8RCGGGTACCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTT- CAAAGACAAATTTGCATATACAGAATAAAGC擴增GP2連入pcDNA3.1(+)

1.3 EBOV GP原核及真核表達載體的構建

以pMD18T-simple-edited GP質粒為模板，用引物Primer1F/Primer1R(包含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)進行PCR擴增，獲得的DNA片段連入pET28a(+)，轉化E.coilJM109，涂布含有50 μg/ml卡那霉素的LB固體平板，篩選出陽性克隆pET28a(+)-sGP。同樣，以pMD18T-simple-edited GP為模板，分別用引物Primer3F/Primer3R、Primer 4F/Primer 4R和Primer5F/Primer5R進行PCR擴增，獲得相應目標片段，分別構建pET28a(+)-GP1(33～313 aa)、pET28a(+)-GP1(190～313 aa)和pET28a(+)-GP2(502～632 aa)重組質粒。所有構建的重組質粒通過酶切和測序進行鑒定。

以pMD18T-simple-edited GP為模板，利用引物Primer6F/Primer6R-1(包含酶切位點KpnⅠ和Hind Ⅲ、ACCATG真核表達標簽和c-myc標簽)進行PCR擴增，再以純化擴增片段為模板，利用引物Primer6F/Primer6R-2進行PCR，將獲得的產物連入pcDNA3.1(+)和pEGFP，轉入E.coilJM109并涂布在含有100 μg/ml氨芐西林的LB固體平板，篩選出陽性克隆pcDNA3.1(+)-edited GP。同樣，用引物Primer7F/Primer7R-1、Primer7F/Primer7R-2和Primer8F/Primer8R進行PCR擴增，獲得目標片段，構建重組質粒pcDNA3.1(+)-GP1和pcDNA3.1 (+)-GP2。所有構建的重組質粒通過酶切和測序進行鑒定。

1.4 EBOV GP的原核表達與純化及多抗制備

將重組質粒pET28a(+)-sGP、pET28a(+)-GP1(33～313 aa)、pET28a(+)-GP1(190～313 aa)、pET28a(+)-GP2(502～632 aa)轉化E.coilBL21(DE3)。重組菌株分別在LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(37 ℃，220 r/min)至600 nm處光密度(optical density，OD)值為0.4，添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，搖床培養(yǎng)過夜(16 ℃，120 r/min)。離心收集菌體(8 000 r/min，30 min)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測上清液和沉淀物中目的蛋白表達情況，切下含目標蛋白的瓊脂條備用。

收集的菌體經(jīng)超聲破碎后，離心收集包涵體(13 000 r/min，30 min)，經(jīng)8 mol/L尿素溶解后，用Ni柱純化，純化蛋白在透析袋里﹝透析液：50 mmol/L Tris pH 7.9、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、50 mmol/L NaCl、10%甘油﹞，4 ℃磁力攪拌下緩慢復性。將含有目標蛋白的瓊脂條和復性純化GP1(33～313 aa)作為免疫原，分別免疫BLAB/c雌鼠，獲得抗血清， -80 ℃保存。

1.5 EBOV GP的真核表達及鑒定

用脂質體LipofectionTM2000(Invitrogen公司)法和磷酸鈣轉染法，將重組質粒pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1和pcDNA3.1(+)-GP2轉染BHK21細胞和HEK293T細胞。轉染24 h后收集細胞，用復性GP1(33～313 aa)制備的抗體經(jīng)蛋白免疫印跡和間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)檢測目的蛋白。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測GP抗體效價

用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測GP 抗體效價。復性純化的GP1(33～313 aa)用包被液(0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)稀釋成1 μg /ml，每孔加入100 μl，4 ℃ 過夜。將割膠純化和變性復性純化的GP1(33～313 aa)抗血清及用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)免疫的對照血清從1∶100開始用稀釋液﹝含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS， pH 7.4﹞倍比稀釋。于450 nm波長處測OD值，630 nm為參考波長。抗體效價定義為：(實驗孔OD450-空白孔OD450)與(陰性孔OD450-空白孔OD450)的比值(P/N)>2.1時的最大血清稀釋倍數(shù)。

2 結果

2.1 EBOV GP的原核表達載體及真核表達載體的構建

EBOV GP是包膜糖蛋白，疏水性較強，在大腸埃希菌中易形成包涵體。成熟的GP在胞內切割為GP1和GP2，兩者通過分子間二硫鍵連接在一起。根據(jù)GP的結構[7]，分別選取GP親水性較強，暴露在空間結構表面的蛋白片段GP1(33～313 aa)、GP1(190～313 aa)、GP2(502～632 aa)及sGP，通過PCR獲得編碼不同GP片段的DNA序列，構建含不同片段的原核表達載體，雙酶切鑒定和測序結果表明插入序列正確(圖1A)。

同時，為研究GP在真核細胞中的表達，構建了pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1、pcDNA3.1(+)-GP2、pEGFP-edited GP等真核表達載體，酶切鑒定結果見圖1B。

2.2 EBOV GP的原核表達和純化及抗血清制備

大腸埃希菌能以包涵體形式表達GP1(33～313 aa)、 GP1(190～313 aa)和sGP，而不能表達 GP2(502～632 aa)(圖2A)。GP1(33～313 aa)包涵體經(jīng)過變性和復性，獲得可溶性蛋白，濃度為0.2 mg/ml(圖2B)。用His tag單克隆抗體(簡稱單抗)對純化的GP1(33～313 aa)進行蛋白免疫印跡驗證(圖2C)。對其他幾種GP片段的誘導表達條件進行了優(yōu)化，仍無法獲得GP在大腸埃希菌中的可溶性表達。

用含有GP1(33～313 aa)的瓊脂條和可溶性蛋白作為抗原免疫BALB/c雌鼠，獲得與GP發(fā)生特異性結合反應的多抗。

ELISA結果顯示，可溶性GP能誘導小鼠產生高效價的抗體，效價為1∶3 200；而用含GP的瓊脂條獲得的抗體效價只有1∶400(表2)。另外，用可溶性蛋白抗原制備的多抗可用于目標蛋白表達的檢測。

表2ELISA檢測血清GP抗體效價

Tab.2TitersofmouseantiseratoEBOVGPassessedbyELISA

免疫抗原小鼠血清稀釋度1/1001/2001/4001/8001/1 6001/3 2001/6 400PBS (P/N)2.531.981.581.461.381.421.36GP(33^313 aa)割膠 (P/N)3.873.232.541.891.561.671.73GP(33^313 aa)復性 (P/N)5.324.874.133.672.982.342.09

A: pET28a(+)(enzyme digestion sites:EcoR Ⅰ andHind Ⅲ). B: pcDNA3.1(+)(enzyme digestion sites:KpnⅠ andHind Ⅲ).

圖1EBOVGP表達載體的酶切鑒定

Fig.1RestrictiondigestionofplasmidsfortheprokaryoticandeukaryoticexpressionofEBOVGP

A: Expressions of GP1(33-313 aa), GP1(190-313 aa), GP2(502-632 aa) and sGP inE.coliBL21(DE3). Expression conditions: IPTG (0.2 mmol/L),OD(0.4), 16 ℃, 8 h, 150 r/min. B. Renaturation and purification of GP1(33-313 aa). C: Western blotting of purified GP1(33-313 aa) using His tag monoantibody. D: Western blotting of expressed GP inE.coliBL21 (DE3). M, marker; sedi, sediment; super, supernatant.

圖2EBOVGP原核表達純化及抗體檢測

Fig.2ProkaryoticexpressionandpurificationofrecombinantEbolavirusGPandpreparationofGPantibody

2.3 EBOV GP的真核表達及鑒定

真核表達載體pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1和pEGFP-edited GP轉染BHK21和HEK293T細胞。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，2種細胞在轉染pEGFP-edited GP后，大多數(shù)細胞能發(fā)綠色熒光(結果未列出)。蛋白免疫印跡結果顯示，edited GP、GP1在HEK293T細胞中特異性表達。成熟的GP在胞內切割為GP1和GP2。myc-tag定位在GP2的C端，GP2相對分子質量較小(18 000)，所以myc抗體在edited GP相應位置沒有出現(xiàn)目的條帶(圖3A)。因為BHK21細胞不含有與pcDNA3.1(+)SV40啟動子結合的啟動蛋白，所以沒有檢測到GP的表達。

用GP多抗和myc單抗進行IFA，結果顯示HEK293T細胞能在細胞質中特異性表達edited GP和GP1，而在BHK21細胞中檢測不到edited GP和GP1的表達(圖3B)。

A: Western blotting of GP expression in HEK293T and BHK21 cells transfected with LipofectionTM2000. B: IFA detection of GP expression in HEK293T and BHK21 cells transfected 24 h later with edited GP and GP1. The secondary antibody was FITC-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody.

圖3EBOVGP的真核表達

Fig.3ExpressionofEBOVGPinHEK293TandBHK21cells

3 討論

GP為EBOV唯一的表面包膜蛋白，是最為理想的誘導宿主產生中和抗體的抗原。本研究利用獲得的全長EBOVGP基因，探究了EBOV GP全長蛋白、GP1和GP2的原核和真核表達，獲得了可溶性GP，制備了具有一定效價的GP多抗，為下一步EBOV特異性檢測技術的建立及其研究奠定了基礎。

EBOV GP在進化過程中形成了一個高效機制，依賴于特殊的復制酶轉錄后剪接機制[8,9]，有效解決了病毒基因組容量小但需多種蛋白參與病毒感染與復制的生命周期問題。GP基因共編碼4種蛋白：sGP、edited GP、GP1和GP2。成熟的GP由GP1和GP2 亞單位形成三角裂杯狀(three lobed chalice shape)的同源三聚體[10]，且高度糖基化。

EBOV GP是一種高度糖基化的膜蛋白，疏水性很強，不利于在原核中可溶性表達，易形成包涵體[11]。本研究通過嘗試將GP1(33～313 aa)、GP1(190～313 aa)、GP2(502～632 aa)及剪接前的全長GP等在大腸埃希菌中表達，通過優(yōu)化表達條件，包括 IPTG濃度(0.1～1 mmol/L)，溫度(16 ℃、20℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃)，轉速(90、120、150、220 r/min)，添助溶劑甘油、巰基乙醇，更換表達菌株E.coil(Rosseta)和載體pGEX6p-1(帶GST標簽)等，仍沒有獲得可溶性表達。因此，實現(xiàn)GP在大腸埃希菌中的可溶性表達還需進一步研究。

GP在EBOV感染和復制過程中起至關重要的作用?，F(xiàn)有研究表明[12,13]，GP參與介導病毒侵入細胞過程，糖基化基團起關鍵作用。糖基化基團還為感染動物提供了很強的免疫原性，使機體產生中和抗體和T細胞反應。研究表明，EBOV GP能引起血管內皮細胞脫離，被認為是埃博拉出血熱患者臨床出血的重要原因[14]。市場上沒有商品化EBOV GP抗體，本研究通過原核表達的包涵體變性、復性、純化，獲得免疫原，免疫小鼠后獲得可靠的EBOV GP抗體，能滿足后續(xù)的研究需求。

致謝

感謝蔡全信先生提供myc單克隆抗體及在實驗技術上給予的支持。

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